Influence of DNA DSB repair on cell sensitivity to chloroethylating cytostatics
Final Report Abstract
Die Chlornitrosoharnstoffe (CNU), zu denen für die Glioblastom-Therapie relevanten Zytostatika Nimustin (ACNU) und Lomustin (CCNU) gehören, wirken zytotoxisch auf Tumorzellen durch Induktion von DNA-Schäden. Zu den toxischsten DNA-Schäden gehören die DNA- Doppelstrangbrüche (DSB), die als Folge der Reparatur von DNA-Interstrangvernetzungen (ICL) entstehen und Apoptose/Nekrose oder Seneszenz auslösen können. Es sind zwei Hauptwege zur DNA-DSB-Reparatur bekannt, die homologe Rekombination (HR) und die nicht-homologe Strangverknüpfung (Non-Homologous-End-Joining, NHEJ). Im Rahmen des vorliegenden Projektes wurden die folgenden Fragenstellungen untersucht: 1) Welche Rolle spielen die MGMT-Expression, die homologe Rekombination (HR) und die DSB- Reparatur in der Resistenz von Zellen (Zytotoxizität, Apoptose-/ Nekroseinduktion) gegen CNU? Hamsterzellen mit Defekten in der HR-Reparatur (BRCA2, Rad51D1 oder XRCC3-Mutanten) zeigten eine signifikant erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ACNU (Nimustin) im Vergleich zu den Wild-Typ-Zelllinien (WT) im Koloniebildung-Test, während die NHEJ-Mutanten eine ähnliche Sensitivität oder nur leichte Sensibilisierung aufwiesen. Die Bestimmung der Apoptose/Nekrose- Induktion im Annexin V-FITC/PI-Test (AV-PI) ergab eine signifikante Erhöhung der Zelltodraten bei HR-Mutanten, die hauptsächlich auf die Apoptose-Induktion zurückzuführen war. BRCA2 und XRCC3 –Mutanten, die mit dem funktionellen humanen MGMT-Gen transfiziert wurden, wurden resistent gegenüber ACNU. 2) Spielen HR und NHEJ eine Rolle in der gentoxischen Wirkung der CNU? Die HR-defekten Zellen (BRCA2, XRCC3 und RAD51D-Mutanten) wiesen spontan eine chromosomale Instabilität auf und reagierten hypersensitiv gegenüber ACNU im Vergleich zum WT. Die NHEJ-Mutanten, dagegen, waren empfindlicher nur gegenüber die höchsten getesteten Konzentrationen. Also korrelierte die CNU-induzierte Gentoxizität mit der Zytotoxizität in den Zelllinien. 3) Wie erfolgt die Bildung und Reparatur der induzierten DSB im „Wildtyp“ und Reparatur-defekten Mutanten und welche Signalwege hierbei eine Rolle spielen? Wir beobachteten signifikante Bildung von Kern-Foci der DSB-Marker γH2AX und 53BP1 nach Behandlung mit ACNU. Die Kinetik der Foci-Bildung und Reparatur war für beide Marker ähnlich und unterstützte das Konzept, dass DSB durch die Prozessierung von ACNU-induzierten ICL erzeugt werden. Bei späteren Zeitpunkten nach der Behandlung nahmen die Foci-Levels in allen WT-Zellen signifikant ab, während in den HR-Mutanten signifikant erhöht blieben (was auf fehlende DSB-Reparatur hinweist). Die NHEJ-Mutanten, dagegen, zeigten eine gering gestörte DSB-Reparatur. 4) Gibt es eine Zellzyklusabhängigkeit bei der Entstehung von DSB? In synchronisierten Hamsterzellen konnten wir nachweisen, dass die Kern-Foci von DNA-Reparaturproteine, die zu den Stellen der DSB rekrutiert werden (γH2AX, ATMS1981, MDC1- und RPA2), sich erst in der S- Phase des Behandlungszyklus bilden und sich während dem G2-Phase-Block anhäufen. 5) Führt die chemische Inhibition von HR-Proteinen (HRi) in Glioblastom-Zellen zu deren Sensibilisierung gegenüber CNU? In kultivierten Glioblastom-Zellen bestätigten wir im Koloniebildung-Test die Sensibilisierung gegenüber CCNU (Lomustin) mit niedermolekularen Inhibitoren des RAD51-Proteins (RI-1, B02) oder MRE11- (Mirin). Die Sensibilisierung war auf die erhöhten Apoptoseraten zurückzuführen, wie im AV/PI-Test gezeigt. Die Aktivierung von Kaspasen und PARP1 bestätigte die Apoptoseinduktion. Die nach CCNU überlebenden Zellen wiesen Merkmale der Seneszenz auf, insbesondere nach HRi. Die ICL-Entstehung und Reparatur wurden im modifizierten Komet-Test mit bestrahlten Zellen demonstriert. Die Bildung und fehlende Reparatur von DSB nach CCNU und HRi wurden durch die Detektion von Kern-Foci der rekrutierten DSB-Marker bestätigt. Eine hemmende Wirkung von CCNU und HRi auf die DNA- Replikation konnte mit Hilfe der DNA-Faser-Technik und des EdU-Einbau-Tests in S-Phase Zellen nachgewiesen werden. Mittels der Methode von EU-Einbau während der RNA-Synthese untersuchten wir die Effekte von CCNU und HRi auf die Transkription, wobei eine eindämmende Wirkung von B02 und Mirin festgestellt wurde. Im subkutanen Xenograft-Modell mit U87MG- Gliomzellen zeigten wir, dass RI-1 signifikant die Tumorzelltoxizität von CCNU erhöht, sodass das Wachstum der subkutanen Tumoren in Nacktmäusen aufgehalten werden kann.
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