smTIRF-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät dient in erster Linie als universelles Hilfsmittel für alle Aufgabenstellungen in Zusammenhang mit bildgebenden Fluoreszenzverfahren. Dies umfasst sowohl die klassische Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie als auch die Total-Internal-Reflection-Fluorescence- oder TIRF-Mikroskopie und die Konfokalmikroskopie. Die einzigartige Ausstattung des Mikroskops erlaubt die Anregung der Proben mit bis zu acht Laserwellenlängen, die in schneller Pulsfolge (im Mikrosekundenbereich) geschaltet werden können. Die flexible Konfiguration erlaubt den schnellen Wechsel zwischen den verschiedenen Betriebsmodi und erlaubt so, dieselbe Probe nacheinander mit verschiedenen fluoreszenzmikroskopischen Verfahren zu untersuchen. Im einzelnen sollen folgende Projekte näher beschrieben werden, welche mit dem System in den letzten Jahren bearbeitet wurden. 1) Mehrfarben-Superresolutions-Mikroskopie durch konfokale Spinning-Disk-Image-Scanning-Mikroskopie (csdISM): Das Prinzip der Superresolutions-Mikroskopie mit ISM wurde 1984 von Colin Sheppard theoretisch formuliert und 2010 von unserer Gruppe experimentell demonstriert. Das Verfahren ist geeignet, fluoreszenzmarkierte Proben aller Art zu untersuchen und erreicht eine dreidimensionale Auflösungsverbesserung um den Faktor zwei im Vergleich zur Auflösung eines klassischen Fluoreszenzmikroskops. Die wesentliche Einschränkung unseres ursprünglichen ersten Aufbaus lag in der langen Aufnahmezeit von ca. einer Minute pro Bild. Mit Hilfe des schnellen Nipkow-Scanners des neuen, hier behandelten smTIRF-Systems konnte das Prinzip massiv parallelisiert werden und Aufnahmezeiten von ca. einer Sekunde pro Bild erreicht werden. Ebenso konnte die volle Vielfarben Fähigkeit des Scanners genutzt werden, um quasisimultan bis zu vier Anregungs- /Emissionswellenlängen anzuregen und auszulesen. In Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von Fred Wouters (Universitätsmedizin Göttingen), Ralph Kehlenbach (Molekularbiologie der Universitätsmedizin Göttingen) und Jörg Großhans (Entwicklungsbiologie der Universitätsmedizin Göttingen) wurde dieses neue Mikroskopieverfahren auf vielfältige biomedizinische Problemstellungen angewendet. Gleichzeitig konnte der Algorithmus zur Auswertung der Rohbilder vereinfacht und beschleunigt werden, so dass eine on-line Verarbeitung möglich ist. Zurzeit arbeiten wir an einer Implementierung der Methode in die offene Mikroskopieplattform µ-Manager. 2) Mehrfarben-SOFI-Mikroskopie an Primärkulturen muriner Neuronen: Stochastic Optical Fluctuation Imaging (SOFI) ist ein weiteres Superresolutions-Verfahren, das in unserer Arbeitsgruppe entwickelt worden ist. Im Gegensatz zu den meisten anderen superauflösenden Mikroskopie-Verfahren bietet es den großen Vorteil, dass es technologisch außerordentlich einfach zu realisieren ist, dass es eine Auflösungsverbesserung in allen drei Raumdimensionen erzielt, den Kontrast der Abbildung dramatisch verbessert, und dreidimensionales Sectioning (also dreidimensionale Mikroskopie) mit einem Weitfeldmikroskop ermöglicht. In dem Projekt, das in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Andreas Neef am Max-Planck-Institut für Nichtlineare Dynamik und Selbstorganisation und im Rahmen des BCCN durchgeführt wird, soll die Struktur der Cluster von spannungsaktivierten Natrium-Kanälen (NaV) im Initialsegment von Axonen mikroskopisch aufgelöst und untersucht werden. Diese Fragestellung ist fundamental wichtig für ein Verständnis der in Nervenzellen beobachteten ultraschnellen Generierung von Aktionspotentialen, welche bisher immer noch nicht quantitativ verstanden ist. Dabei spielt die Bestimmung der räumlichen Verteilung der Cluster sowie der Anzahl der einzelnen Kanäle in den Clustern eine wesentliche Rolle. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Ulf Diederichsen aus der Fakultät für Chemie wurden inzwischen erfolgreich NaV-spezifische Toxine (auf der Basis der Conotoxine von Kegelschnecken) synthetisiert und fluoreszent markiert, und wir sind mitten in den aufwändigen Tests, das Bindeverhalten der Toxine an die Kanäle zu charakterisieren und dabei auch die Markierungseffizienz der Kanäle mit dem smTIRF-System umfänglich zu analysieren. Ein wichtiger Teilaspekt des Projektes ist dabei die Kolokalisierung der Kanäle hinsichtlich zu Zytoskelett-Strukturen der Neuronen. Entsprechend haben wir erfolgreich eine Mehrfarben-Präparation von Aktin, Spectrin und Membran in primären neuronalen Zellkulturen des Hippocampus von Mäusen realisiert und damit erfolgreich SOFI-Mikroskopie betrieben. 3) Mehrfarben TIRF-Video-Mikroskopie von lebender Dictyostelium discoideum. D. discoideum ist ein Modellorganismus zur Untersuchung der Chemotaxis. Die Motilität des einzelligen Organismus erfordert den ständigen koordinierten Umbau des Cytoskeletts, im besonderen des Aktin-Netzwerkes. Im dem hier beschriebenen Projekt in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Eberhard Bodenschatz am Max-Planck-Institut für Nichtlineare Dynamik und Selbstorganisation sollen hier in erster Linie in vivo die räumliche Verteilung des Aktinnetzwerkes und der gezielte Auf- und Abbau von Pseudopodien untersucht werden. An diesen Prozessen sind verschiedene Proteine (Rac, Scar/WAVE, WASP) beteiligt, welche mit fluoreszenten Proteinen spezifisch markiert wurden. Ein ganz wesentlicher Aspekt des Projektes ist es, die räumliche Verteilung des Aktin-Netzwerkes und der markierten Proteine mit maximaler Geschwindigkeit und möglichst in drei Dimensionen abbilden zu können. Mit unserem smTRIF-System waren und sind wir in der Lage, mehrfarbige Bilder mit bis zu 100 Bildern pro Sekunde aufzunehmen und damit erstmals Prozesse in D. discoideum zeitlich aufzulösen, welche vorher so schnell nicht zugänglich waren. Die Projekte 2) und 3) befinden sich noch mitten in der Bearbeitung und werden in den nächsten Jahren im Rahmen des BCCN und des SFB937 weitergeführt werden. Beide Projekte benötigen enorm viel Zeit und Aufwand für die Probenpräparation (spezifische Fluoreszenzfärbung neuronaler Zellen, Synthese und Erprobung spezifischer fluoreszent markierter Toxine, genetische Mutation von D. discoideum zur Fluoreszenzmarkierung mit fluoreszenten Proteinen).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Resolution doubling in fluorescence microscopy with Confocal Spinning-Disk Image Scanning Microscopy. PNAS 110 (2013) 21000-5
Schulz, O.; Pieper, C.; Clever, M.; Pfaff, J.; Ruhlandt, A.; Kehlenbach, R.H.; Wouters, F.S.; Großhans, J.; Bunt, G.; Enderlein, J.
