Generation of gene-activating pH signals in plant cells
Final Report Abstract
Das Projekt diente der Charakterisierung einer Signalkaskade, welche die Bildung cytotoxischer Alkaloide als Reaktion auf pathogenen Mikroben auslöst. Vorausgegangene Arbeiten hatten wesentliche Ereignisse dieses Signalwegs in Zellkulturen von Eschscholzia californica identifiziert: a) Ein mikrobieller Elicitor (isoliert aus Hefe-Zellwand) aktiviert die Phospholipase A2 (PLA2) an der Plasmamembran und führt zum transienten Anstieg von Lysophosphatidylcholin (LPC). b) LPC löst an der Vakuole einen transienten Efflux von Protonen aus. c) Der daraus resultierende peak der zytoplasmatischen H+Konzentration bewirkt die Induktion von Enzymen der Biosynthese von Benzophenanthridin-Alkaloiden. Die berichteten Arbeiten haben zwei essentielle Proteine dieses LPC/pH Signalwegs identifiziert und ihre molekulare Funktion bei der Entstehung des zentralen pH-Signals demonstriert: das Schlüsselenzym PLA2 und den für den pH shift verantwortlichen Na+/H+ Antiporter des Tonoplasten. 1. PLA2 liegt an der Plasmamembran in variablen Komplexen mit Gα-Proteinen vor, welche die Aktivität des Enzyms hemmen. Die für die Assoziation verfügbare Menge an löslichem Gα wird durch Di- oder Oligomerisierung limitiert. Elicitor-Kontakt in Gegenwart von GTP führt zur Freisetzung von aktiver PLA2, die vermutete Konformationsänderung wird durch ein an der Plasmamembran aufgefundenes Cyclophilin A katalysiert. 2. Die als Pathogen-Antwort produzierten Benzophenanthridine üben eine weitreichende feedback-Kontrolle über das Schlüsselenzym des Signalwegs aus: die PLA2 der Plasmamembran wird durch diese Alkaloide in physiologischrelevanten Konzentrationen deutlich gehemmt. Dies erklärt die Abschaltung der Induktion von Biosynthese-Enzymen durch die gebildeten Alkaloideauch in Anwesenheit des Elicitors. Ein ähnlicher Kontrollmechanismus wurde in Zellkulturen von Catharanthus roseus gefunden, welche die medizinisch wertvollen Indol-Alkaloide Vincristin und Vinblastin produzieren. Letztere hemmen die PLA2 in der Plasmamembran von Catharanthus, kaum jedoch von Eschscholzia. Die transiente Expression der PLA2-Gene in Nicotiana benthamiana führte zu rekombinanten Enzymen mit der Alkaloid-Empfindlichkeit aus ihrer Herkunftspflanze, d.h. das in Eschscholzia-DNA kodierte Enzym wird durch Benzophenanthridine gehemmt, nicht jedoch durch Vincristin und Vinblastin. Die im Catharanthus-Genom kodierte PLA2 besitzt die umgekehrte Sensitivität. 3D Modelle der PLA2 aus beiden Arzneipflanzen zeigen je eine potentielle Bindestelle für die "eigenen", nicht jedoch für die in der anderen Pflanze produzierten Alkaloide. Offenbar hat die Evolution molekulare "Abdrücke" der produzierten Toxine in Schlüsselenzymen hinterlassen, die dem Schutz der Produzenten vor einer Selbst-Intoxikation dienen. 3. Nachdem vorausgehende Arbeiten die Beteiligung von Na+/H+ Antiportern am pH shift zur Induktion von Biosynthese-Enzymen nahegelegt hatten, wurden via PCR vier in Eschscholzia exprimierte NHX-Gene aufgefunden (EcNHX1-4). Sie kodieren Na+/H+ Antiporter mit hoher Sequenzähnlichkeit zu vakuolär lokalisierten Isoformen aus anderen Pflanzen. RNAi-basiertes gene silencing lieferte Zellstämme mit verminderter Expression von NHX-Genen, geringerer Aktivität des Na+/H+ Antiports und Stimulierbarkeit durch LPC, zusammen mit fehlender Elicitierbarkeit der Alkaloidbildung. Jedes der 4 EcNHX -Gene wurde in einer Δnhx-Nullmutante von Saccharomyces exprimiert und führte zur Rekonstitution des fehlenden Na+/H+ Antiports. Eine Stimulation dieser Aktivität durch LPC wurde ausschließlich in den EcNHX1 exprimierenden Hefestämmen gefunden. 3D Homologie-Modelle zeigen nur für dieses Protein eine plausible, hochspezifische Bindestelle für LPC. EcNHX1 ist also der gesuchte, durch LPC stimulierte Na+/H+ Antiporter, an dem das pH Signal zur Expression des Sekundärstoffwechsels generiert wird. Die Auffindung von Phospholipasen, die Alkaloide ihrer Herkunftspflanze mit hoher Selektivität "erkennen", gehört zu den positiven Überraschungen dieses Projekts. Ein reviewer von Plant Cell hat sie als ein "breakthrough paradigm"eingestuft. In der Tat öffnet sich damit ein neuer Blick auf die Einbettung des Spezialisierungs-Stoffwechsels in die ökologische Strategie von Pflanzen: Toxine verbleiben auch nach ihrer Freisetzung unter zellulärer Kontrolle und können dadurch ohne wesentliche Gefährdung der eigenen fitness als Phytoalexine fungieren.
Publications
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