Neo-Hybrid Liver Graft - An new approach using autologous hepatocytes and hepatic progenitor cells for reducing immunosuppression after liver transplantation
Final Report Abstract
Nach wie vor ist die Lebertransplantation die Standardtherapie bei Lebererkrankungen im Endstadium. Aufgrund akuter und chronischer Abstoßungsrektionen und massiver Nebenwirkungen einer lebenslang notwendigen Immunsuppression sind neue Konzepte gefragt, die eine operationale Toleranz, d.h. eine Langzeittransplantatfunktion ohne Immunsuppression, ermöglichen. Wir entwickelten das Konzept der Autologisierung allogener Transplantate (Neohybrid Liver Graft): Durch eine Repopulierung des allogenen Transplantats mit autologen adulten Hepatozyten und hepatischen Vorläuferzellen, die aus Leberexplantaten/-resektaten des Empfängers gewonnen werden können, soll nach kombinierter Leber-/Leberzelltransplantation eine sukzessive Autologisierung des allogenen Transplantats erreicht werden. Projekt I: Im experimentellen Transplantationsmodell der Ratte wurden männliche Lewis-Ratten als Zellspender verwendet, um in der Folge die transplantierten Zellen anhand des Y-Chromosoms mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (FISH) in weiblichen Lewis-Empfängertieren nachweisen zu können. Durch subkutane Applikation von 2-Acetylaminofluoren (2-AAF) und/oder partieller Hepatektomie (PH, 70%) wurde vorab die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung adulter Hepatozyten und hepatischer Vorläuferzellen in den männlichen Lewis-Zellspendern induziert. Die kombinierte Leber-/ Leberzelltransplantation (LTx/HCTx) wurde in einem akuten Abstoßungsmodell mit weiblichen Dark-Agouti-Ratten als Spender und weiblichen Lewis-Ratten als Empfänger durchgeführt (Immunsuppression Tag 0-7, 4 mg/kg Cyclosporin; danach 2 mg/kg KG). Männliche Dark Agouti-Organspender wurden zuvor mit Retrorsin, einem hepatotoxischen Pyrrolizidinalkaloid, zur Blockierung des Zellzyklus der Transplantat-eigenen Zellen vorbehandelt um die Rebesiedlung des Transplantats mit den autologen Zellen zu begünstigen. 24 Stunden nach Lebertransplantation erhielten die Tiere eine Kombination aus adulten Hepatozyten und Zellen aus der Progenitorzell-angereicherten nicht-parenchymalen Fraktion (NPC). Die transplantierten Tiere wurden post OP beobachtet und zu den vorgesehenen Zeitpunkten finalisiert (max. 90 Tage). Unter kontinuierlicher Immunsuppression war die kombinierte Leber/-Leberzelltransplantation erfolgreich: die Empfänger zeigten bis zu 90 Tagen eine stabile Leberfunktion, histologisch waren keine Anzeichen einer akuten Abstoßung zu erkennen. Männliche Zellen aus vorbehandelten Zellspendern konnten bis zu 90 Tage im Transplantat nachgewiesen werden. Histologisch zeigte sich eine heterogene Verteilung der transplantierten Zellen; immunhistochemische Färbungen des Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen (PCNA) zeigten proliferierende Zellen. Das Ergebnis konnte über den Nachweis des Y-Chromosoms (FISH) sowie männlicher gDNA (qPCR) bestätigt werden. Projekt II: Die Isolierung, Anreicherung, Kultivierung und Charakterisierung von humanen adulten Hepatozyten und Vorläuferzellen aus Resektaten und Explantaten erkrankter Lebern konnte mit modifizierten Protokollen optimiert werden. Bei Verwendung von Explantaten wurden deutlich bessere Ergebnisse bei Lebern von Patienten mit PSC im Vergleich zu zirrhotischen Explantaten erzielt. Tendenziell war ein größerer prozentualer Anteil EpCAM+CD45- Vorläuferzellen in der NPC-Fraktion von Leberexplantaten im Vergleich zu Resektaten nachzuweisen. Die Repopulierungskapazität (Viabilität, Engraftment und Proliferation) der isolierten humanen Zellen wurde anschließend in vivo durch eine Transplantation in immundefiziente SCID-Mäuse überprüft. In ersten Untersuchungen gelang der Nachweis der transplantierten Zellen in der Mausleber bis zu 30 Tage nach Zelltransplantation. Für eine klinische Adaptierung des Modells muss für die optimale Rebesiedelung des allogenen Transplantats der Proliferationsvorteil der transplantierten autologen Zellen durch nicht destruktive Strategien erreicht werden. Wir entwickelten hierfür spezielle superparamagnetische Eisenoxidpartikel, welche nach Inkorporation in die zu transplantierenden Zellen nicht nur eine Verfolgung der Zellen (Tracking) mittels MRT ermöglichen, sondern auch eine selektive Manipulation im Sinne einer Proliferations-Stimulierung ermöglichen könnten.
Publications
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