Haarsinneszell-Mess-System
Final Report Abstract
Das Haarsinneszell-Mess-System, dessen wichtigste Komponente ein aufrechtes konfokales Laserscan-Mikroskop ist, wurde für kombinierte Imaging- und Patch-Clamp-Messungen sowie für Calcium-Imaging- Experimente und für Immunfluoreszenzaufnahmen eingesetzt. Ziel der Experimente ist das bessere anatomische und physiologische Verständnis der Zellen der Gehörschnecke (Cochlea) der Maus, insbesondere der Haarsinneszellen. Sie dienen als Modell für die Abläufe in der Cochlea des Menschen unter normalen sowie unter pathologischen Bedingungen. Die wichtigsten Forschungsprojekte werden im Folgenden aufgeführt: 1. Identifizierung und Charakterisierung der akzessorischen α2δ- und β-Untereinheiten und der Splicevarianten der Cav1.3-Calciumkanäle von inneren Haarsinneszellen der Maus. Für die schall-gekoppelte Transmitterausschüttung der Haarsinneszellen sind präsynaptische Calciumkanäle nötig, die aus den Untereinheiten Cav1.3 und β2 bestehen und außergewöhnliche Eigenschaften besitzen. Zur weiteren Aufklärung der Zusammensetzung und Funktion der Calciumkanäle wurde der Phänotyp der inneren Haarsinneszellen mit Mehrfach-Immunfluoreszenzmarkierungen untersucht. Es wurde die subzelluläre Expression und Lokalisation der Calciumkanäle und ihre Lokalisation an den Ribbonsynapsen fixierter Corti-Organe von Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit Deletion von α2δ2 und β2 bzw. mit Mutation einer Splicevariante des Cav1.3-Calciumkanals mit einem 63 x Ölobjektiv analysiert. 2. Rolle der BK-Kalium-Kanäle von inneren Haarsinneszellen der Maus und Aufklärung der Ursachen ihres ungewöhnlichen Aktivierungsverhaltens. In diesem Projekt wurden immunhistochemisch zwei Populationen der BK-Kanäle der inneren Haarsinneszelle nachgewiesen. Mit Stapelaufnahmen von Doppelimmunfluoreszenzmarkierungen zeigten wir, dass die große Population der BK-Kanäle im supranukleären Bereich der Zelle größtenteils sehr nahe an Strukturen des endoplasmatischen Retikulums liegt. Die BK-Kanäle könnte durch Calcium-Freisetzung aus dem ER in ihren Eigenschaften moduliert werden, was in einem weiterführenden Projekt untersucht wird. 3. Charakterisierung der Calciumkanäle und -ströme von Spiralganglienneuronen der Maus und Untersuchung der Rolle von α2δ3 Calciumkanal-Untereinheiten. Wir konnten zeigen, dass α2δ3 essentiell für die korrekte Ausbildung der Hörnervsynapse ist, und analysierten daher die Rolle von α2δ3 für die Expression der unterschiedlichen Typen spannungsgesteuerter Calciumkanäle. Dafür wurden mit Immunfluoreszenz Mehrfachmarkierungen von Calciumkanaluntereinheiten und Zelltypmarkern an akut präparierten und an dissoziierten, primär kultivierten Spiralganglien durchgeführt. Es zeigte sich, dass in reifen Spiralganglienneuronen α2δ3 unerlässlich für die Expression von P/Q-Typ-Kanälen, nicht jedoch von L-Typ-Kanälen, ist. 4. Charakterisierung der Calcium-Spontanaktivität während der Entwicklung der Cochlea. In diesem Projekt geht es um die Wechselwirkung von Calcium-Wellen in Stützzellen mit Calcium-Transienten in Haarsinneszellen, um die Aufklärung der ihnen zugrunde liegenden Mechanismen und um eine mögliche funktionelle Kopplung von Haarsinneszellen. Die Calciumaktivität des sich ausdifferenzierenden Corti-Organs wurde mit Hilfe des Calcium-Indikators Fluo-8-AM mit Hilfe von schnellem Calcium-Imaging mit einem 40x Wasserobjektiv am akuten präparierten Corti-Organ untersucht. Die spontan auftretenden Calciumwellen im Kölliker-Organ konnte mit Antagonisten der P2X-/P2Y-Rezeptoren unterdrückt werden. Calcium-basierte Aktionspotentiale der inneren Haarsinneszellen waren teilweise von der Aktivität des Kölliker-Organs unabhängig; teilweise jedoch an dessen Aktivität gekoppelt. 5. Expression und Funktion von TRPM3-Kanälen in der Cochlea der Maus. Verlässliche Antikörper gegen TRPM3 stehen derzeit nicht zur Verfügung. Deshalb wurde das zelluläre Expressionsmuster des TRPM3-Kanals durch Messung der Live-Fluoreszenz von GFP, das unter dem Promotor von TRPM3 stand, mittels Stapelaufnahmen und 3D-Rekonstruktion bestimmt. Der Kanal wird in den meisten Stützzelltypen der Cochlea exprimiert. Zusammenfassend hat uns das Haarsinneszell-Mess-System ermöglicht, konfokale Stapel von Mehrfach- Immunfluoreszenzaufnahmen am mehrschichtigen Corti-Organ, an Spiralgangliengewebe und anderen Geweben mit hoher Sensitivität und diffraktionslimitierter Auflösung durchzuführen und diese Stapel als Maximum-Intensitätsprojektion oder als 3D-Rekonstruktion weiter auszuwerten. Des Weiteren haben wir schnelles und empfindliches Live-Imaging und Calcium-Imaging mit Fluo-8-AM an diesen Präparaten etabliert und erlangten so völlig neue Einblicke in die Spontanaktivität der sich entwickelnden Cochlea. Kombinierte Patch-Clamp- und Calcium-Imaging-Versuche werden zukünftig neue Einblicke in die Kopplung der verschiedenen Phänomene der Spontanaktivität im Kölliker-Organ und in Haarsinneszellen bringen.
Publications
- Rolle von α2δ-Untereinheiten spannungsgesteuerter Calciumkanäle und Modulation von BK-Kanälen in inneren Haarsinneszellen der Säugercochlea. Dissertation, Universität des Saarlandes, 2013
Fell, B
- alpha2delta3 is essential for normal structure and function of auditory nerve synapses and is a novel candidate for auditory processing disorders. Journal of Neuroscience 34 (2014), 434-445
Pirone A, Kurt S, Zuccotti A, Rüttiger L, Pilz P, Brown DH, Franz C, Schweizer M, Rust MB, Rübsamen R, Friauf E, Knipper M, Engel J
(See online at https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3085-13.2014)
