Quantitative Charakterisierung von Protein-Sekretionsmustern in Caspase-1-assoziierten Sekretomen
Final Report Abstract
In der ersten Förderphase wurde die markierungsfreie quantitative massenspektrometrische Sekretomanalyse als Methode entwickelt und im Zellkulturmodell angewandt. Die Validierung der mehr als 200 differentiell sekretierten Proteine durch orthogonale Methoden wie ELISA, CBA-Assays oder Western Blot wurde jedoch durch die mangelnde kommerzielle Verfügbarkeit entsprechender quantitativer Assays und Antikörper limitiert. Ziel der zweiten Förderphase war die Entwicklung einer sensitiven massenspektrometrischen Methodik zur schnellen absoluten Quantifizierung von Proteinen. Diese Methode sollte sowohl die Vergleichbarkeit massenspektrometrischer Analysen mit bereits etablierten Methoden, z.B. ELISA-, CBA-Assays oder Western Blot, ermöglichen als auch eine Perspektive für die diagnostische Anwendung eröffnen. Zu diesem Zweck sollte die rekombinante Expression isotopenmarkierter Standardpeptide etabliert werden, welche die schnelle und flexible Generierung einer großen Anzahl von quantitativen Standards für die massenspektrometrische Analytik erlaubt und somit eine Übertragung explorativer analytischer Analysen, wie der Sekretomanalyse durch markierungsfreie Massenspektrometrie, zur Anwendung im Tiermodell bis hin zu Patientenproben ermöglicht. Der MS-Western kombiniert die etablierten Methoden der Isotopenmarkierung zur Peptid-Quantifizierung, der GeLC-MS/MS und der massenspektrometrischen Protein-Quantifizierung mittels der intensivsten Peptide (MI3/Hi3). Wir haben eine effiziente Methode zur rekombinanten Expression konkatierter Peptide etablieren können mit der in einem einzigen Produktionsschritt quantitative Standardpeptide (n≧3 pro Protein) für zahlreiche Proteine erzeugt werden konnten. Die Expressionskonstrukte werden durch kommerzielle Gensynthese erzeugt und stehen somit innerhalb weniger Wochen zur Verfügung. Probleme in Bezug auf die Löslichkeit der exprimierten Konkatamere werden durch die denaturierenden Bedingungen des SDS-Gels umgangen. Durch die hohe Expressionseffizienz und Molekulargewichtsauftrennung im SDS-Gel sind auch keine weiteren Aufreinigungsschritte erforderlich. Die Auswahl entsprechender quantitativer (quantotypischer) Peptide erfolgt entweder aus eigenen vorangegangenen Experimenten, z.B. der Sekretomanalyse, oder auf Basis von Daten aus der wissenschaftlichen Literatur und korrespondierenden massenspektrometrischen Daten, die in zunehmendem Maß zur Verfügung stehen. Mit der Erzeugung eines einzelnen Konkatamers können quantitative Standardpeptide für zahlreiche Proteine in einem Arbeitsschritt hergestellt werden. Der MS-Western erreicht einen großen dynamischen Bereich (>105) bei hoher Sensitivität mit unteren Quantifikationsgrenzen im Bereich weniger Femtomol Protein auf dem SDS-Gel. Befinden sich die Proteine im gleichen zu analysieren SDS-Gelbereich können sie parallel in einem Experiment quantifiziert werden womit durch geeignetes Multiplexing ein hoher Probendurchsatz erreichbar ist. Mit der Entwicklung des MS-Western wurde ein zentrales Ziel der zweiten Förderperiode erreicht und eine Technologie etabliert, die nun für zukünftige Anwendungen und Kooperationen zur Verfügung steht.
Publications
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