Differenzierung von Autofluoreszenzsignaturen zur Online-Erfassung bakterieller Kontaminanten in der automatisierten Fleischzerlegung
Final Report Abstract
Ziel dieses Teilprojektes war die grundlegende Untersuchung der Signalentwicklungsmechanismen von nativen fluoreszierenden Substanzen in Abhängigkeit vom bakteriellen Befall einer Schweinefleischmatrix. Dabei sollten gezielt fluoreszenzbasierte Techniken unter Einbeziehung neuartiger Auswertealgorithmen zur Echtzeiterkennung von bakteriellen Verunreinigungen auf einer Fleischoberfläche abgeleitet werden, um wesentliche Grundlagen für ein Kontaminationsmonitoring in automatisierten Prozessketten im Sinne eines „Minimal Processing“ bereit zu stellen. Nach der Bestimmung der Ausgangssituation der bakteriellen Kontamination von Schweinefleisch wurden für die weiteren Untersuchungen exemplarisch sowohl Bakterienstämme von der DSMZ (P. fluorescens, E. coli, Carnobacterium divergens und Brochothrix thermosphacta) als auch direkt vom Fleisch isolierte Bakterien (Pseudomonas spp., P. fluorescens, Carnobacterium maltaromaticum und Brochothrix thermosphacta) ausgewählt. Die Messung der Autofluoreszenzsignale dieser untersuchten Bakterien zeigte sowohl auf Einzelzellebene (in der Durchflusszytometrie) als auch in Suspension (in der Fluoreszenzspektroskopie) Unterschiede in der Intensität im Verlauf der verschiedenen Wachstumszeiten, es war jedoch kein Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Membranpotential oder Esteraseaktivität erkennbar. Bei den detektierten Fluoreszenzsignalen handelte es sich primär um aromatische Aminosäuren, NADH sowie Porphyrine. Bei einer Anregung mit 420 nm liegt die Porphyrinfluoreszenz von Protoporphyrin und Zink-Protoporphyin in einem Wellenlängenbereich von ca. 550 – 710 nm. Im Spektrometer waren die Fluoreszenzintensitäten der Bakteriensuspensionen allerdings deutlich geringer als auf der Fleischmatrix, auch nach Veränderung der Wachstumstemperatur und Zugabe einer Eiweißquelle. Auf Nähragarplatten mit Myoglobinzugabe waren P. fluorescens und B. thermosphacta in der Lage, Porphyrine zu bilden, dies konnte jedoch nicht für C. divergens dargestellt werden. Bei einer zusätzlich durchgeführten spezifischen Beimpfung von Fleisch mit P. fluorescens und B. thermosphacta zeigten sich deutlich höhere Fluoreszenzintensitäten als beim unbehandelten Fleisch. Die durchschnittlichen Fehler der Vorhersagen (mean absolute percentage error, MAPE) lagen bei P. fluorescens bei ca. 3 % und bei B. thermosphacta bei ca. 9 %. Zur Einschätzung des Einflusses fleischeigener Enzyme auf die Porphyrinbildung wurde eine Dekontamination der Fleischoberfläche mit indirektem Plasma durchgeführt. Diese führte zum Ausbleiben sowohl des Gesamtkeimzahlanstieges als auch der Fluoreszenzintensitätserhöhung. Außerdem wurde eine Ermittlung von Gesamtkeimzahl, Zink-Protoporphyrin-Gehalt und Fluoreszenzintensität zum besseren Vergleich jeweils an derselben Probe durchgeführt. Eine partial least squares regression (PLSR) ermittelte hierbei eine deutliche Korrelation zwischen Gesamtkeimzahl und Fluoreszenz mit einem MAPE von ca. 5 % für die Vorhersage. Man kann also daraus schließen, dass die Mikroorganismen in erster Linie mitverantwortlich sind für das auftretende, Porphyrin bedingte Fluoreszenzsignal, allerdings nicht alle Bakterien gleichermaßen in der Lage sind, Porphyrine zu bilden. Eine zufriedenstellende Korrelation zwischen Fluoreszenzintensität und Zink-Protoporphyrin- Gehalt konnte leider nicht ermittelt werden. Dies kann vermutlich auf die produktspezifischen Herausforderungen bei der Schichtdickenerfassung der Fleischoberflächen, die zur Analyse in der HPLC verwendet wurden, zurückgeführt werden. So wurde möglicherweise für die Fluoreszenz mitverantwortliches Zink-Protoporphyrin, welches im Spektrometer eine Intensitätserhöhung bewirkte, in der HPLC nicht erfasst und führte so zu einer Verschlechterung der Korrelation. Anhand der grundlegenden Untersuchungen wurden wichtige Wellenlängenbereiche identifiziert, die auf ein bildgebendes System der Fluoreszenzmessung (PSI (Photon Systems Instruments), Brno, Tschechien) übertragen werden konnten, um mit Hilfe vereinfachter Datenauswertungsmodelle und kostengünstigeren Komponenten den zeitlichen Aufwand der Messung im Prozessablauf erheblich zu reduzieren und ein onlinefähiges Messsystem zu ermöglichen. Mit dem verwendeten bildgebenden System (λex/em = 420/570-730 nm) war eine ortsaufgelöste Messung der bakteriellen Belastung von Schweinefleischoberflächen prinzipiell möglich. Der Fehler des Messsystems betrug dabei 0,9 log KbE/cm² und das untere Detektionslimit lag bei 4,4 log KbE/cm². Die erreichte Genauigkeit entspricht damit etwa der klassischen mikrobiologischen Referenzmethode. Durch die benötige Dauer von etwa 2 s für eine einzelne Messung ist eine Onlinefähigkeit gegeben. Ein direkt in die Produktionslinie integriertes Kontaminationsmonitoring einzelner Fleischpartien könnte sich somit umsetzen lassen.
Publications
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