Anreicherung von oralen Krebsstammzellen und Analyse der Expression von Cancer/Testis Antigenen: Auswirkungen auf die Behandlung des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle
Final Report Abstract
Bei Plattenepithelcarcinomen der Mundhöhle (PECM) ist nur eine kleine Zahl der Zellmasse, die so genannten Tumorstammzellen (CSC), für den Erhalt des Tumors, die Ausbildung von Metastasen und, wegen ihrer Resistenz gegenüber den angewandten Therapien, für die Ausbildung von Rezidiven verantwortlich. Zum besseren Verständnis der Erkrankung und somit zur Verbesserung der Therapieansätze ist eine Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung dieser Zellen zwingend nötig. Bisher gelang es aber nicht, diese Zellen zu isolieren. Lediglich Zellpopulationen, die Zellen mit Stammzelleigenschaften umfassen, konnten mit dem Ziel ein besonderes Merkmal zur Isolierung der CSC zu finden, bereits untersucht werden. Ziel des Projekts war es, Stammzellfraktionen aus dem PECM anzureichern, molekularbiologisch zu untersuchen und neue Stammzellmarker zu identifizieren. Zusätzlich sollte die Expression MAGE-A bestimmt werden, um ihre Bedeutung für die Eliminierung der CSC durch immuntherapeutische Ansätze zu bestimmen.. Zur Separation der Stammzellfraktionen wurden Kulturen von primären Zellen aus frisch entnommenem Gewebe von Plattenepithelcarcinomen der Mundhöhle gewählt. Diese bildeten in niedrigen Passagen in serumfreien Medium Sphäroide aus. Dies stellt ein für eine Krebsstammzelle typisches Phänomen dar. In höheren Passagen weisen die primären Tumorzelllinien diese Stammzelleigenschaft nicht oder in nicht mehr erkennbarer Häufigkeit auf. Sie zeigen nun wie die permanenten Tumorzelllinien keine Sphäroidbildung mehr, sondern wachsen auch in serumfreien Medium adhärend aus. Diese Veränderung spiegelte sich auch in den Genexpressionsanalysen wieder. Es konnte in höheren Passagen keine einheitliche Überexpression von als Stammzellmarker bezeichneten Genen festgestellt werden. Auch war die Expression dieser Gene in den verschiedenen Zelllinien und Zellklonen sehr heterogen und ihre Expression scheint zudem von der Wachstumsphase der Zellkulturen abhängig zu sein. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Expressionsanalysen nur in Sphäroiden primärer Zellpopulationen kurz nach der Anzucht an direkten Zelllysaten oder nach Prä-Amplifikation der cDNA durchgeführt werden sollten, da hier die Zellen mit Stammzellcharakter noch zahlreich sind. Bei permanenten Tumorzelllinien erwies sich eine weitere Eigenschaft der Stammzellen für eine Anreicherung von Stammzellfraktionen als geeignet. Diese Stammzellpopulation, die als Side Population (SP) bezeichnet wird, zeigt verstärkten Efflux des Farbstoffes Hoechst Dye. Es gelang, über fluoreszenz-aktivierte Separation eine kleine Zellzahl der SP zu isolieren. Diese Zellen wurden in serumfreiem Medium vermehrt und molekularbiologisch charakterisiert. Die Analysen zeigten, dass sich die Expressionsmuster der SP mit der Anzahl der Passagen dem Expressionsmuster der Zellen der unfraktionierten Kultur und der Non Side Population anglichen. Zur Identifizierung von molekularen Markern, die für CSC charakteristisch sind, scheinen somit auch hier nur Analysen direkt nach der Fraktionierung sinnvoll zu sein. Dazu muss die Fraktionierung in großen Maßstab durchgeführt werden oder bei kleinen Zellzahlen die Untersuchung wie bei der Expressionsanalyse der Sphäroide direkt in den Zelllysaten oder nach einer Prä-Amplifikation der cDNA erfolgen. Im Rahmen des Projekts konnte gezeigt werden, dass Populationen, die CSC enthalten, über die Ausbildung von Sphäroiden aus primären Tumorzellen und über Fluoreszenz-aktivierte Separation bei Verwendung des Farbstoffes Hoechst Dye anreichert werden können. Für die Identifikation von Stammzellmarkern über Expressionsanalysen sollten nur frisch fraktionierte und/oder primäre Tumorzellen, die in serumfreien Medium angezogen werden und die phänotypisch stammzellspezifischen Sphäroide ausbilden, verwendet werden.
