Inverses Fluoreszenz-Mikroskop
Final Report Abstract
Am Lehrstuhl für Mikrobiologie untersuchen wir dynamische RNA-Regulationsprozesse während der pathogenen Entwicklung von Ustilago maydis. Hier ist der Langstreckentransport entlang von Mikrotubuli wichtig für das polare Wachstum der Infektionshyphen. Ein Schlüsselfaktor ist das RNA-bindende Protein Rrm4. Mit dem hier beantragten inversen Fluoreszenzmikroskops wurden entscheidende Fortschritte gemacht. Ein Durchbruch war die Beobachtung, dass der mRNA-Transport entlang von Endosomen erfolgt. Dies konnten wir mithilfe von dynamischen Ko-Lokalisationsstudien zeigen. Zu diesem Zweck wurden transgene Pilzstämme über homologe Rekombination hergestellt, die sowohl Rrm4 fusioniert an das rot fluoreszierende Protein mCherry als auch Endosomenmarker fusioniert an das grün fluoreszierende Protein eGfp exprimierten. Mithilfe der msALEX-Technik (millisecond alternating laser excitation microscopy) und dem Dualview-Detektionssystem gelang es uns, gleichzeitig die Bewegung des RNA-bindenden Proteins und des Markerproteins mit einer Geschwindigkeit von 2,5 µm pro Sekunde in vivo nachzuweisen. Weiterführende Experimente belegten klar, dass der Mechanismus des mikrotubuliabhängigen mRNA-Transports der Ko-Transport mit Endosomens ist. Dies ist ein neuartiger Mechanismus, denn bislang wurde nur der Ko-Transport von mRNAs und endoplasmatischem Reticulum in S. cerevisiae beschrieben. Als nächsten Schritt untersuchten wir die mögliche cdc3 Ziel-mRNA, die für ein Septin kodiert. Durch RNA- Lebendzellbeobachtungen haben wir gezeigt, dass cdc3 mRNA tatsächlich auf Endosomen transportiert wird. Interessanterweise wurde auch das Cdc3-Protein dort nachgewiesen. Die Beobachtung, dass sowohl mRNA als auch das Translationsprodukt Endosom-abhängig transportiert werden, führte zu der Hypothese, dass die Septin mRNA während des Transports translatiert wird. Mithilfe unseres sensitiven Systems konnten wir tatsächlich in vivo zeigen, das mRNA und Protein auf ein und demselben Endosom kotransportiert werden. Die Hypothese wurde durch die Beobachtung untermauert, dass auch Ribosomen auf Endosomen transportiert wurden und dass für die Anwesenheit des Translationsproduktes das Vorhandensein der mRNA erforderlich war. Folglich konnten wir erstmalig die Endosomen-gekoppelte Translation als neuen zellbiologischen Prozess aufdecken. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse eines zweiten Septins, Cdc12, ergab, dass auch dieses auf Endosomen transportiert wird. Vermutlich werden heterooligomere Septinkomplexe auf Endosomen zusammengebaut, denn ohne Cdc3 ist kein Cdc12 auf Endosomen zu finden. Bislang wurden diese Vesikel als frühe Endosomen klassifiziert und sind somit für das Recycling von Membranproteinen verantwortlich. Wir konnten jedoch zeigen, dass neusynthetisiertes Protein auf Endosomen lokalisiert. Mit Hilfe der 2D-FRAP Einheit unseres Mikroskops konnten wir eindeutig belegen, dass ein Nettotransport von Septinen mittels Endosomen zur Wachstumsspitze der Hyphe erfolgt. Folglich werden diese Endosomen für den Mikrotubuli-Transport von mRNAs und Septinen verwendet. Diese neuen Erkenntnisse stimmen mit aktuellen Beobachtungen aus anderen Modellsystemen überein. So werden auch andere makromolekulare Ribonucleoprotein-Komplexe an Membransystemen zusammengebaut. In tierischen Zellen wurde z.B. beobachtet, dass der RNAi RISC-Komplex eng mit dem Endomembran-System interagiert und dass RNA humanpathogener Viren auf Endosomen transportiert wird. Neben diesen Kernprojekten wurde das Fluoreszensmikroskop auch in eine Reihe anderer Projekte integriert. Proteomanalysen und Floureszenzmikroskopie zeigten, dass die Chitinase Cts1 in Mutanten des mRNA-Transports spezifisch in Hyphen akkumuliert. Außerdem ist der mikrotubuliabhängige mRNA- Transport für die Sekretion von Cts1 wichtig. Es handelt sich hierbei um einen neuartigen unkonventionellen Sekretionsweg, der mittlerweile genutzt wird, um heterologe Proteine, wie bestimmte Antikörperformate, nach außen zu schleusen. In Zusammenarbeit mit Prof. Fischer vom KIT haben wir einen Übersichtsartikel über die fluoreszensmikroskopische Analyse von Endosomen in Pilzen verfasst und mithilfe der Golden Gate-Klonierung haben wir eine effiziente Möglichkeit geschaffen, Fusionsproteine mit fluoreszierenden Proteinen in Pilzen zu exprimieren.
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