Structure, dynamics and function of spin labeled G proteins activated by dimerization studied by multi-frequency cw and pulsed EPR
Final Report Abstract
GADs, G-Proteine, welche durch Dimerisierung aktiviert werden, scheinen sich zunächst grundsätzlich von den sogenannten kleinen G-Proteinen, beispielsweise der Ras-Proteinfamilie, zu unterscheiden. Letztere benötigen für eine effektive GTP-Hydrolyse GEFs (Guaninenucleotide exchange factors) und GAPs (GTPase activating proteins) als Hilfs- bzw. regulatorische Proteine. Demgegenüber komplementieren in ‚typischen‘ GADs wie MnmE oder hGBP1 Seitenketten bzw. Strukturelemente der jeweils anderen G-Domäne im Dimer das katalytische Zentrum der GTPase. Die RocCOR-Tandem-Domäne in Roco-Proteinen wie der „Parkinson-Kinase“ hLRRK2 allerdings zeigt typische Eigenschaften beider Klassen von GTPasen. Zum einen gibt es ein Nukleotid-abhängiges Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer (und oligomere Formen gebunden an Mikrotubuli), wobei Strukturdaten für ein bakterielles Roco-Protein eine direkte Interaktion der G-Domänen, und somit die typische Eigenschaft eines GAD, zeigen. Andererseits ist das katalytische Verhalten der hLRRK2-RocCOR-GTPase eher mit dem „klassischer“ Ras-Proteine vergleichbar, und eine kürzlich veröffentliche Cryo-EM-Struktur eines Dimers der C-terminalen, katalytischen, Hälfte von hLRRK2 zeigt eng miteinander interagierende COR-Domänen aber in großem Abstand zueinander angeordnete, d.h. nicht interagierende, G-Domänen. Zur Charakterisierung der Interaktionen im hLRRK2-RocCOR-Dimer wurden für Spin-markierte Varianten eines hLRRK2-RocCOR-Konstruktes mittels DEER- Spektroskopie Modulationstiefen und Abstandsverteilungen unter verschiedenen Bedingungen bestimmt. Die in Anwesenheit unterschiedlicher Nukleotide bestimmten Modulationstiefen zeigen eine deutliche Nukleotid-Abhängigkeit der Dimerisierung, wobei der höchste Anteil von Dimeren in Anwesenheit von GDP beobachtet wird. Der Vergleich der erhaltenen Abstandsdaten mit aus MD-Simulationen von alternativen Dimer-Modellen, darunter ein selbstentwickeltes Homologie- Modell des hLRRK2-RocCOR-Dimers basierend auf Strukturdaten des bakteriellen Roco- Proteins, berechneten Abstandsverteilungen favorisieren eindeutig Dimer-Anordnungen mit interagierenden G-Domänen. Ebenfalls vergleichbar mit den für bakterielles Roco beobachteten Abstandsverteilungen zeigt sich auch für das hLRRK2-RocCOR-Dimer eine hohe Konformationsdynamik, gekennzeichnet durch breite und multimodale Abstandsverteilungen. Eine Analyse der Dimerisierung von N-Ras, bei welcher Anhand von DEER- und Fluoreszenz- Daten und dem Vergleich mit Strukturmodellen die Membran-gebundene Dimer-Form der GTPase identifiziert werden konnte, zeigt ein orthogonal zu der Interaktionsfläche in RocCOR angeordnetes Dimer. Vor dem Hintergrund der Ras-ähnlichen GTPase-Aktivität und einer Nukleotid-regulierten Dimerisierung könnte das Monomer/Dimer-Gleichgewicht in welchem hLRRK2 sich befindet so beispielsweise zu Zugänglichkeit für - noch nicht schlüssig identifizierte - GEFs und/oder GAPs regulieren. Noch abzuschließende Auswertungen von MD-Simulationen im µs-Bereich zur Charakterisierung des Konformationsraumes von Strukturmodellen des MnmE-Dimers zeigen das auch experimentell beobachtete Gleichgewicht zwischen ‚offener‘ und ‚geschlossener‘ Anordnung der G-Domänen in GTP(GppNHp)-gebundener Form. Dabei zeigte sich eine allosterische Kopplung zwischen der G-Domänen-Bewegung und der Ausrichtung der helikalen Domänen, an welche potentiell das „Partnerprotein“ GidA bindet, um einen enzymatisch aktiven Komplex zu bilden.
Publications
- (2016). Application of site-directed spin labelling for studying conformational changes in the catalytic cycle of G proteins activated by dimerization. Electron Paramagnetic Resonance, Vol. 25, 157-179
Klare, J.P.
(See online at https://doi.org/10.1039/9781782629436-00157) - (2020). Identification and disruption of the atomic Ras dimer interface
Rudack, T., Teuber, C., Scherlo, M., Güldenhaupt, J., Schartner, J., Klare, J.P., Gerwert, K., Kötting, C.
(See online at https://doi.org/10.26434/chemrxiv.14039810.v1)
