Triple-Quadrupol-Massenspektrometer
Final Report Abstract
Das mit einer 1290-UHPLC-Anlage gekoppelte 5500 QTRAP-Massenspektrometer wird von der Serviceeinheit Massenspektrometrie (zuvor: Serviceeinheit des Life Science Centers) der Universität Hohenheim betrieben und überwiegend im Rahmen von Serviceanalysen für Arbeitsgruppen der Universität Hohenheim sowie in Verbundprojekten mit Beteiligung von Hohenheimer Arbeitsgruppen eingesetzt. Das QTRAP-Massenspektrometer wird dabei sowohl für die quantitative Proteinanalytik als auch für quantitative Analysen von Metaboliten verwendet. Dabei lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren aufgrund des hohen Bedarfs auf der Analytik von Metaboliten/kleinen Molekülen. Bisher wurden Forschungsprojekte von elf Hohenheimer Fachgebieten sowie von externen Kooperationspartnern unterstützt, von denen hier die wichtigsten aufgelistet sind. Im Bereich Proteinanalytik wurden mit dem QTRAP-MS Methoden für eine Quantifizierung von Proteinen und postranslationalen Proteinmodifikationen mittels SRM (Selected Reaction Monitoring) etabliert. Diese Methoden wurden unter anderem in einem BMBF-Projekt mit Beteilgung der Serviceeinheit eingesetzt, in dem quantitative Proteomanalysen des Bakteriums Pseudomonas putida durchgeführt wurden, um die Auswirkung verschiedener Solventien in biotechnologischen Prozessen zu untersuchen. Hierbei wurde das QTRAP-MS für die Verifizierung potentiell regulierter Proteine aus 2-D DIGE Analysen eingesetzt, wodurch in ca. 70% der fraglichen Spots die tatsächlich regulierten Proteine identifiziert werden konnten. Screening-Methoden für Serin/Threonin- und Tyrosin-Phosphopeptide sowie Glykopeptide mittels Precursor-Ionen- bzw. Neutralverlust-Scans wurden ebenfalls etabliert. Die Screening-Methoden für Phosphopepitde wurden parallel zu Messungen mit einem LTQ-Orbitrap Massenspektrometer in zwei Projekten des Fachgebietes Biosensorik eingesetzt, in denen die lichtabhängige Phosphorylierung der am Sehprozess in Drosophila melanogaster beteiligten Ionenkanäle TRP und TRPL untersucht wurde. Im Bereich der Analyse von Metaboliten/kleinen Molekülen wurden am QTRAP-MS unter anderem SRM- und Precursor-Ion Scan-Methoden für die Quantifizierung von Lipiden, Fettsäuren, Mono- und Disacchariden, Neurotransmittern, Steroidhormonen, Glucosinolaten, Flavonoiden, cyanogenen Glycosiden und Pestiziden etabliert. Im Rahmen des bereits erwähnten BMBF-Forschungsprojektes wurden mit Hilfe des QTRAP-MS SRM-Analysen von Produkten des Vanillin-Metabolismus in P. putida KT2440 durchgeführt. Weiterhin wurden die Veränderungen der Zusammensetzung von Membranlipiden in P. putida KT2440 in Gegenwart von n-Butanol untersucht. Ein Projekt aus der Lebensmittelchemie (Prof. Schwack) beschäftigte sich mit der Entwicklung einer Analysenmethode für Pestizidrückstände in grünem Tee. In diesem Projekt konnten in einer SRM-Analyse von 7 repräsentativen Pestiziden, die Tee-Proben zugesetzt wurden, Wiederfindungsraten im Bereich von 81-104% (RSD 1,2-4,9%) und eine Sensitivität von S/N > 10 bei Pestizid-Konzentrationen ≤ 0,002 mg/kg erzielt werden. In Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen „Biodiversität und pflanzliche Interaktion“ (Prof. Spring) und Bioorganische Chemie (Prof. Beifuß) wurde eine Charakterisierung des Metaboloms der Drüsenhaare der Sonnenblume durchgeführt. Dabei wurde das QTRAP-MS für die Suche nach Methylflavonen des Nevadensin- bzw. Xanthomicrol-Typs und deren Identifizierung eingesetzt. In einem Projekt der Arbeitsgruppe Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen (Prof. Schaller) wurde die Rolle der sogenannten Dirigent-Proteine bei der stereoselektiven Biosynthese des sekundären Pflanzenmetaboliten (+)- bzw. (-)-Gossypol untersucht. Nach stereospezifischer HPLC-Trennung konnte über SRM- und MS/MS- Analysen am QTRAP-MS bestätigt werden, dass die Funktion der Dirigent-Proteine GhDIR3, GhDIR4 und GbDIR2 entscheidend für die stereoselektive Biosynthese von (+)-Gossypol ist. Die quantitative Analyse der Neurotransmitter Serotonin, Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin stand im Mittelpunkt eines ernährungsmedizinischen Projektes (Fachgebiet Ernährungsmedizin, Prof. Bischoff), welches sich mit der Nicht-alkoholischen Fettleber-Erkrankung (NAFLD) beschäftigte. Hierbei wurde der Einfluß von fructose- und fettreicher Ernährung auf die Ausbildung der NAFLD untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Serotonin-Konzentrationen im Gastrointestinaltrakt bei fructosereicher Ernährung deutlich erhöht sind, während andere Neurotransmitter keine Rolle zu spielen scheinen. In einer weiteren ernährungsmedizinischen Langzeitstudie des Fachgebiets Ernährungsmedizin wurden in 360 Blut- und Stuhl-Proben mit Hilfe von SRM-Analysen die Konzentrationen von 206 Metaboliten bestimmt. Hierfür wurden die p180- und Bile Acid-Kits eines einschlägigen Herstellers verwendet. Ziel der Studie ist es, die Auswirkungen einer Ernährungs- und Lebensstilumstellung auf den Stoffwechsel und die Brustkrebsinzidenz von Frauen zu untersuchen, die aufgrund von Genmutationen ein erhöhtes Risiko für Brustkrebs besitzen. Bislang wurden 2 Zeitpunkte (vor Ernährungsumstellung und 3 Monate nach Ernährungsumstellung) erfasst. Die statistische Auswertung der Daten ist noch nicht abgeschlossen. Abhängig von den Ergebnissen wird eventuell noch ein weiterer Zeitpunkt (1 Jahr nach Ernährungsumstellung) untersucht.
