2-Photonen Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop mit konfokaler Laserausstattung
Final Report Abstract
Untersuchungen über die Rolle von BDNF beim Übergang von funktioneller zu struktureller Plastizität an exzitatorischen und inhibitorischen Synapsen: Innerhalb der Neurotrophine hat BDNF eine Sonderstellung in dem Sinne, als dass es bei der aktivitätsabhängigen synaptischen Plastizität, vor allem bei der Induktion und Aufrechterhaltung von LTP, eine instrumentelle Rolle spielt. Offen ist die Frage, ob BDNF auch ein wichtiger Mediator zwischen funktioneller und struktureller Plastizität ist. So konnte gezeigt werden, dass morphologische Veränderungen nach der Induktion einer Langzeit-Potenzierung eintreten.Welche zellulären und molekularen Mechanismen diesen Übergang von funktioneller (Verstärkung oder Abschwächung) zu struktureller Plastizität vermitteln, ist bisher nicht geklärt. Unsere Hypothese ist, dass BDNF hier ein entscheidender Mediator ist, in dem es die lokale Proteinsynthese von Cytoskelett-Komponenten entscheidend mit steuert. Und in der Tat konnten erste Experimente in dieser Richtung belegen, das BDNF genau diese Funktion übernehmen könnte. Folgende Experimente haben wir mit Hilfe des 1-Photonen/2-Photonen LSM durchgeführt bzw. führen wir aktuell durch: Mit einer lokalen Pipette wird BDNF auf einzelne spines von hippokampalen Pyramidenzellen in organotypischen Kulturen der Maus appliziert. Zeitgleich mit der BDNF-Applikation wird Glutamat mit Hilfe des 2-Photonen Lasers freigesetzt (unter zu Hilfenahme von caged-Glutamat). Dabei wird dann mit Hilfe des 2-Photonen-LSMs ein Ca2+-imaging in spines durchgeführt. Die Frage, die hier beantwortet werden soll, ist, ob die BDNF-Applikation die Ca2+-Dynamik in spines verändert, vor allem ob BDNF eine Verlagerung des Ca2+ -Signals aus spines in die Dendriten bewirken könnte. In einem weiteren Experiment wird mit Hilfe von Sensoren der Aktin-Polymerisation ermittelt, welche morphologische Veränderungen auf eine veränderte Aktin-Polymerisation zurückzuführen sind. Hier ist der Einsatz neuer kleiner Peptide möglich, die F-Aktin binden und so sichtbar machen, jedoch die Polymerisation nicht behindern. Bei diesen Experimenten wird der konfokale Bestandteil des LSMs benötigt. Nachdem diese technisch anspruchsvolle Art der Detektion von spine-Veränderungen etabliert war, wurde mit dieser Methodik an verschiedenen knockin- und knockout-Mauslinien untersucht, unter welchen Bedingungen die spine-Morphologie-Dynamik verändert ist. Insbesondere werden die im Labor verfügbaren TrkB.T1 (Kinase-defiziente splice-Variante des TrkB Rezeptors) überexprimierenden Neurone und TrkB überexprimierende Neurone untersucht. Entscheidend war auch, die Rolle von endogenem BDNF in BDNF-KO Tieren zu untersuchen. Hierzu wird in vivo mit Hilfe des Ca2+-imaging die Dynamik der spine-Morphologie in BDNF-KO Tieren mit Hilfe der 2-Photonen LSMs untersucht. Die neuronalen Aktivitätsbedingungen werden hierbei aktuell mit Channelrhodopsin (Zhang et al., 2008) genau kontrolliert. Weitere Projekte, für die das Gerät genutzt wird: Funktionelle Charakterisierung der Wirkungsweise von Aβ auf die strukturelle Re-Organisationen von Dendriten und Synapsen im Hippocampus der Maus/Ratte; Untersuchungen über die aktivitätsabhängig induzierte Aktindynamik in Neuronen als Folge von Vorgängen, die mit synaptischer Plastizität in Beziehung stehen; Regulation der Stabilisierung von Synapsen durch NogoA.
Publications
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