Ivestigations of the role of the AvrRpt2Ea effector protein within the host-pathogen interaction Malus x robusta 5-Erwinia amylovora
Final Report Abstract
Die Feuerbrandkrankheit wird durch das Bakterium Erwinia amylovora hervorgerufen und hat sich in den letzten Jahren zu einem Problem im Apfelanbau entwickelt. Die Untersuchung von Resistenz- und Virulenzfaktoren und deren Interaktion trägt zum allgemeinen Verständnis der Wirt-Pathogen-Beziehung bei und dient als Grundlage für die Entwicklung von effizienten Bekämpfungsstrategien. Einer der Virulenzfaktoren von E. amylovora ist AvrRpt2EA. Für dieses Protein konnte bereits gezeigt werden, dass es vom Erreger gebildet und in die pflanzlichen Wirtszellen sekretiert wird. Obwohl AvrRpt2EA eine zentrale Rolle in der Interaktion von Bakterium und Wirtspflanze spielt, ist über seine Funktion auf molekularer Ebene nur wenig bekannt. Ziel des Projektes war es, die allgemeinen und speziellen Auswirkungen von AvrRpt2EA auf die Wirtspflanze zu untersuchen. Weiterhin sollten mögliche Zielproteine dieses Effektorproteins in der Wirtspflanze identifiziert und charakterisiert werden. Anschließend sollte geprüft werden, ob diese Zielproteine proteolytisch von AvrRpt2EA gespaltet werden. Für die Untersuchung der allgemeinen und speziellen Auswirkungen von AvrRpt2EA auf die Wirtspflanze wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurden Inokulationsversuche mit Hilfe eines AvrRpt2EA-komplementierten P. syringae pv. tomato DC3000 Stammes durchgeführt. Es zeigte sich jedoch, dass dieser Ansatz für die Untersuchung der Funktion von AvrRpt2EA nicht zielführend war. Ein Nachweis der Sekretion von AvrRpt2EA war mit den getesteten beiden Antikörpern auch nicht möglich. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Apfelpflanzen untersucht, die infolge einer Hitzeschockbehandlung AvrRpt2EA exprimieren. Es erfolgte eine detaillierte Charakterisierung zur Transgenität dieser Linien sowie der Nachweis der Induzierbarkeit der AvrRpt2EA-Expression. Nach Induktion zeigten die Pflanzen phänotypische Veränderungen, die mit der typischen Symptomatik einer natürlichen Feuerbrandinfektion vergleichbar sind. Damit konnte gezeigt werden, dass AvrRpt2EA in einem anfälligen Apfelgenotyp als Virulenzfaktor agiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass AvrRpt2EA keine Auswirkung auf den Stoffwechsel verschiedener phenolischer Substanzen sowie auf das Öffnen und Schließen der Stomata hat. Eine Aussage zum Einfluss von AvrRpt2EA auf die Ausbildung reaktiver Sauerstoffspezies war aufgrund methodischer Schwierigkeiten nicht möglich. Mit Hilfe von Genexpressionsanalysen und metabolischem Profiling war es jedoch möglich, zu zeigen, dass AvrRpt2EA die Bildung von Salicylsäure (SA) und den SA-abhängigen Weg der systemisch induzierten Resistenz steuert. Dadurch lässt sich auch die Ausbildung von Nekrosen im Pflanzengewebe erklären. Es ist zu vermuten, dass diese Manipulation des pflanzlichen Stoffwechsels die Ernährungsgrundlage für den nekrotrophen Erreger sichert. Mit Hilfe von bioinformatischen Analysen und der Genomsequenz der Apfelsorte ’Golden Delicious’ wurden 19 Kandidatengene identifiziert, deren Proteine eine putative AvrRpt2- Schnittstellensequenz besitzen und somit potentielle Ziele der Protease AvrRpt2EA darstellen. Für 11 dieser Kandidatengene war ein Nachweis der mRNA-Expression im Pflanzengewebe mittels RT-PCR vor und nach der Infektion mit E. amylovora möglich. Für die funktionelle Überprüfung der putativen Schnittstellen wurde zunächst eine Methode zur transienten T- DNA-Transformation in N. benthamiana getestet. Der anschließende Nachweis der exprimierten Proteine mittels Western Blot war erfolgreich. Der ursprüngliche methodische Ansatz zur Überprüfung der Proteolyse von Zielproteinen des AvrRpt2EA-Effektors wurde aufgrund seiner mangelhaften Aussagekraft verworfen. Damit ergab sich die Notwendigkeit, ein vollständig neues Nachweisverfahren zu etablieren, mit welchem ein direkter Nachweis der Proteolyse des Zielproteins nach Co-Expression von Zielprotein und AvrRpt2EA möglich ist. Hierfür wurden neue Konstrukte kloniert. Die transiente Transkription aller neuen Konstrukte in N. benthamiana sowie der Nachweis von AvrRpt2EA auf Proteinebene konnte bereits gezeigt werden. Für die Fertigstellung der Arbeiten sind jedoch noch weitere Untersuchungen notwendig.
Publications
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