Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Das konfokale Laser-Scanning Mikroskop (CSLM) ist mit innovativen Lösungen ausgestattet, die in den wissenschaftlichen Arbeiten mit dem Gerät ausgenutzt wurden. Ein Alleinstellungsmerkmal des Gerätes ist der akusto-optische beamsplitter (AOBS) in Kombination mit einem spektralen Detektorsystem, bestehend aus vier Photomultipliern. Dies ermöglicht die Anregung der Probe mit unterschiedlichen Laserwellenlängen und einer spektral aufgelösten Detektion ohne auf spezielle Filterkombinationen beschränkt zu sein. Mit Hilfe dieser Technik ist auch die Aufnahme von Fluoreszenzspektren mit dem Mikroskop möglich. Anwendung in der Pharmazeutischen Technologie. Ein wichtiges Anwendungsgebiet des Gerätes ist die Quantifizierung von Wirkstoffen und die Untersuchung der Penetration dieser Wirkstoffe in die Haut. Das Problem der Diskriminierung eines an einen Wirkstoff gekoppelten Farbstoffs gegenüber der Autofluoreszenz der Haut wurde über die spektralen Unterschiede gelöst. Über eine anschließende rechnergestützte Auswertung konnte der verwendete Farbstoff anhand seines Spektrums von der Autofluoreszenz der Haut diskriminiert werden und somit das Penetrationsverhalten von Emulsionen mit verschiedenen Penetrationsverstärkern untersucht werden. Die Analyse der Struktur von multiplen Emulsionen ist ein weiteres wichtiges Anwendungsfeld. Aufgrund der dreidimensional sehr heterogenen und optisch sehr komplexen Struktur dieser Emulsionen ist die klassische Weitfeldmikroskopie für eine tiefergehende Strukturanalyse ungeeignet. Mithilfe der konfokalen Volumenbildgebung werden verschiedene multiple Emulsionen bewertet und der Zusammenhang zwischen der Struktur und Qualitätsparametern, wie der Stabilität und der Freisetzung hergestellt. Die Haut als inhomogenes, biologisches Gewebe erfordert innovative Verfahren zur Quantifizierung von Wirkstoffen. So wurden zum einen Hautmodelle (Phantome) erstellt, deren optischen Eigenschaften zur Optimierung mit dem Gerät charakterisiert wurden. Es wurde das Autofluoreszenzspektrum der Haut nachgebildet und mit der spektralen Detektion des Mikroskops analysiert. Die Schichtdicken des Phantoms wurden mit Hilfe von xz-Reflexionsmessung am Mikroskop bestimmt und der Streukoeffizient konnte über die reflexions-basierte Konfokalmikroskopie mit dem Gerät bestimmt werden. Weiter konnte mit dem Gerät eine wichtige Grundlage für ein später beantragtes Projekt (Monapi) gelegt werden. In diesem Projekt wird eine mobile Diagnoseeinheit zum Nachweis von Pilzinfektionen der Haut entwickelt. Die in der Vorbereitungs- und Antragsphase notwendigen Grundlagenuntersuchungen wurden mit dem geförderten Gerät durchgeführt und waren somit ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Antragstellung. Anwendung in der Bioverfahrenstechnik, Membrantechnologie und Zellkulturtechnik. Eine besondere Bedeutung in der Fluoreszenzmikroskopie tragen die verwendeten Fluorophore. Mit dem geförderten Gerät wurden Untersuchungen mit Nanodiamanten, einer neuen Gruppe von Fluoreszenzmarkern, durchgeführt. Neben diversen Tests wurden sie an einem konkreten Beispiel angewendet. Zur Untersuchung des Filtrationsverhaltens von Endotoxin an Membranen wurden die Nanodiamanten an das Endotoxin gekoppelt und mit dem Mikroskop visualisiert. Spektrum, Fluoreszenzstabilität und Anlagerung bei der Filtration an der Membran wurden untersucht. Solche Fouling-Effekte wurden auch mit fluoreszenzmarkierten Endotoxinen analysiert und quantifiziert. Ähnliche Verfahren wurden bei der Herstellung von Fructo-/Galactooligosacchariden angewendet. In diesem Projekt wurde der Rückhalt der beteiligten Enzyme im Membranbioreaktor untersucht. Dazu wurden die Enzyme fluoreszenzmarkiert und der Membranrückhalt mittels des CSLM untersucht. Die Volumenbildgebung des geförderten Gerätes ermöglicht zudem die Visualisierung von 3D Gebilden. Dies wurde in diversen Projekten (z.B. Prozessintensivierung von Stammzellexpansionsprozessen, Herstellungs- und Aufreinungsverfahren therapeutischer Viren, Entwicklung von Zelltherapeutika zur Bandscheibenregeneration etc.) genutzt. bei vielen dieser Projekte werden Zellen dreidimensional auf Trägern oder in Matrices kultiviert. Ein Problem ist es diese Zellen dreidimensional darzustellen und zu analysieren. Mittels des CSLMs wurden diese Zellen auf Trägern fluoreszenzgefärbt und dreidimensional auf der Wachstumsoberfläche visualisiert. Dadurch waren eine Quantifizierung der Zellen sowie eine Homogenitätsbetrachtung möglich. Zudem wurde das CSLM genutzt, um Anheftungs- und Ablösevorgänge von Zellen auf Trägern zu untersuchen. Durch die Nutzung GFP-getaggter Viren konnten Infektionsverläufe dreidimensional aufgelöst dargestellt werden. Durch Tot- Lebend-Färbung und eine direkte Quantifizierung der Vitalität konnte eine einfache Methode zur Bestimmung der Vitalität dreidimensionaler Gebilde etabliert werden. Ein weiteres breites Anwendungsgebiet war die Immunofluoreszenz von differenzierten Stammzellen in 3D. So konnten verschiedene Differenzierungsmarker im Dreidimensionalen analysiert werden. Neben diesen Anwendungen, welche entweder auf die räumlich dreidimensionale Auflösung oder auf die variable spektrale Detektion angewiesen sind, wird das Gerät derzeit routinemäßig in der Frühphase von Projekten, welche eine Fluoreszenzbildgebung beinhalten, angewendet. Durch den, auf dem konfokalen Prinzip basierenden hohen Kontrast und durch den flexiblen Detektionsmechanismus lässt sich die Qualität einer Fluoreszenzfärbung sehr gut beurteilen. Nachdem die Färbeprotokolle mithilfe des Gerätes optimiert wurden, werden die Proben mithilfe eines klassischen Weitfeldmikroskopes im weiteren Verlauf der Projekte untersucht. Untersucht und optimiert wurden somit die viabilitätsabhängige Anfärbung von Pilzaggregaten, die Transfektionseffizienz von verschiedenen Transfektionsverfahren bei Insektenzellen und die Färbung von verschiedenen Zellbestandteilen.
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