Automatisiertes Hochdurchsatz-System
Final Report Abstract
1. Optimierung einer Aldehyd Dehydrogenase: Die Aldehyd Dehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum wurde hinsichtlich ihrer Löslichkeit bei heterologer Expression und ihrer Lösungsmittelstabilität mittels gerichteter Evolution verbessert. Ein weiteres Ziel des Hochdurchsatz-Screenings war die Verschiebung der Cofaktornutzung von NADP+ zu NAD+. Hierfür wurde ein hochentwickeltes Screening-System entwickelt, dass die gesamte Prozedur von der Kultivierung von E. coli-Zellen bis hin zum photometrischen Assay im Roboter erlaubt. 2. Optimierung einer Dihydroxysäure Dehydratase: Die Dihydroxysäure Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus wurde mittels gerichteter Evolution optimiert, um eine verbesserte Umsetzung der beiden Substrate Glycerat und Glukonat zu erzielen. Hierfür wurde ein aufwändiger, über mehrere Tage laufender Aktivitätsnachweis für die Nutzung im Liquid Handling System entwickelt. 3. Erhöhung der allgemeinen Aktivität einer Ketolsäure Reduktoisomerase: die Cofaktorpräferenz der Ketolsäure Reduktoisomerase aus Meiothermus ruber wurde vom phosphorylierten Redoxcofaktor NADP+ zu NAD+ mittels gerichteter Evolution geändert. Zudem erfolgten Anpassungen ihrer Thermo- und Lösungsmittelstabilität. 4. Optimierung einer α-Ketosäure Decarboxylase für die Decarboxylierung nicht-natürlicher Substrate: Das Substratspektrum der α-Ketosäure Decarboxylase aus Lactococcus lactis wurde für die Umsetzung des Substrates 5-Hydroxyvalerat optimiert. Der hierfür notwendige Aktivitätsnachweis wurde von Grund auf für die Nutzung im automatisierten Umfeld entwickelt. 5. Verschiebung der Cofaktor-Akzeptanz einer Alkohol Dehydrogenase: Die Cofaktorpräferenz der Alkohol Dehydrogenase AdhZ3 aus Escherichia coli wurde durch semi-rationales Design von NADP+ zu NAD+ verschoben. 6. Erweiterung des Substratspektrums einer Cytochrom P450 Monooxygenase: Für die Umsetzung von Terpenen wurden chimäre Gensequenzen aus fünf verschiedenen homologen P450-Enzymen erstellt und auf verbesserte Eigenschaften hin untersucht. Ein bestehender Aktivitätsnachweis wurde hierfür speziell an die Anforderungen des Labor-Roboters angepasst. 7. Automatisierung eines Nachweises für phenolische Komponenten: Für den Nachweis des Gesamtphenolgehaltes aus verschiedenen Lignozellulose-Aufschlüssen wurde der bereits bekannte Folin-Ciocalteau-Nachweis auf das Liquid-Handling System übertragen. Auf diese Weise konnte der Probendurchsatz bei verbesserter Präzision stark erhöht werden. Damit wurde die Analyse der Bestandteile von hydrothermal erhaltenen Lignozellulosehydrolysaten, der enzymatischen oxidativen Detoxifizierung dieser Hydrolysate und der enzymatischen reduktiven Etherspaltung in Lignin ermöglicht.
Publications
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