Molekulare Charakterisierung des Gatingmechanismus der Kationenkanäle TRPM2 und TRPM8
Final Report Abstract
In diesem Projekt wurde die Aufklärung des Gatingmechanismus von zwei Kationenkanälen aus der Familie der Transient Receptor Potential (TRP)-Kanäle weiter vorangetrieben. Die beiden ausgewählten Kanäle TRPM2 und TRPM8 sind in mehrfacher Hinsicht besonders interessant. Sie zeigen die größte Sequenzhomologie innerhalb der TRP-Familie, werden durch völlig verschiedene Stimuli aktiviert und spielen außerdem bei unterschiedlichen physiologischen Prozessen eine zentrale Rolle. Für TRPM8 wurde bereits vor Beginn dieses Projekts von anderen Arbeitsgruppen gezeigt, dass es sich im Prinzip um einen spannungsabhängigen Kanal handelt, dessen Aktivierungsmechanismus durch weitere Faktoren (pflanzliche Wirkstoffe, Temperatur) modifiziert wird. Inzwischen haben umfangreiche Genbankanalysen gezeigt, dass TRPM2 einen evolutionären Vorläufer von TRPM8 darstellt. Über den Gatingmechanismus von TRPM2, eines Kanals, der die durch oxidativen Stress induzierte Apoptose vermittelt, war zu Beginn dieses Projekts wenig bekannt. TRPM2 enthält C-terminal die NUDT9H-Enzymdomäne, deren Substrat ADP-ribose die Öffnung der Pore induziert. Unsere eigene Arbeitsgruppe konnte aber zeigen, dass die Bindung von ADP-ribose an die NUDT9H-Domäne und nicht die enzymatische Spaltung für die Aktivierung des Kanals wichtig ist. Die im Laufe dieses Projektes ermittelten Daten zeigen, dass einige der bei beiden Kanälen konservierten Strukturen für das Gating eine ähnliche Bedeutung haben. Dazu gehören das so genannte Sensormodul in Transmembransegment 3 und die S5-Pore-S6-Domäne, insbesondere deren zytoplasmatischer Abschnitt. Für TRPM8 wurde erstmalig eine für die Aktivierung des Kanals essentielle Wechselwirkung, zwischen dem Sensormodul in S3 und dem Spannungssensor in S4, nachgewiesen. Bei TRPM2 konnte zwar ebenfalls eine kritische Rolle des Sensormoduls in S3 für das Gating des Kanals demonstriert werden aber eine Interaktion mit anderen Domänen des Kanals, insbesondere der NUDT9H-Domäne, ist bislang noch nicht gelungen. Letztendlich wurde bei TRPM2 kein Beleg für eine direkte Interaktion zwischen Kanaldomäne und Enzymdomäne gefunden. Detaillierte elektrophysiologische Analysen zeigen, dass das charakteristische Schaltverhalten von TRPM2, durch Einfügen der kompletten S5-Pore-S6-Domäne aus TRPM8, nicht verändert wird, ebenso wenig die Sensitivität gegenüber ADP-ribose bzw. H2O2. Umgekehrt führt die in TRPM2 eingesetzte S5-Pore-S6-Domäne von TRPM8 zum Ausfall der Funktion. Bei TRPM8 könnte demnach eine, in Analogie zu den klassischen spannungsabhängigen Kationenkanälen existierende Ereigniskette der Aktivierung, ausgehend von den Transmembransegmenten S2 und S3, dann über S4 und den S4-S5-Linker auf das eigentliche Gate innerhalb S6, durch die TRPM2-Pore unterbrochen werden. Im Umkehrschluss ist für TRPM2 wiederum, ein von diesem klassischen Modell abweichender Aktivierungsmechanismus denkbar. Dafür spricht auch unsere Entdeckung, dass eine C-terminal angehängte NUDT9H-Domäne die Funktion des TRPM8-Kanals, auch in Anwesenheit des Agonisten ADP-ribose, in keiner Weise beeinträchtigt, also sehr wahrscheinlich nicht mit den einzelnen Komponenten der Gatingmaschinerie von TRPM8 interagiert. Ebenso enthält die Proteinstruktur eines TRPM2- Kanals, nach Abspaltung der NUDT9H-Domäne, immer noch alle wesentlichen Elemente inS1 bis S6, welche bei TRPM8 für die Aktivierung wichtig sind. Gleichwohl ist dieser verkürzteTRPM2-Kanal durch Kälte, Menthol bzw. Icilin nicht stimulierbar. Weitere Forschungsanstrengungen sind daher notwendig, um den einzigartigen Gatingmechanismus von TRPM2 vollständig aufklären zu können. Dabei sollte der Fokus auch auf der Charakterisierung von TRPM2-Varianten liegen, welche aus Organismen stammen, die innerhalb der langen Entwicklungsgeschichte des Kanals möglichst primitive Evolutionsstufen repräsentieren. Gleichzeitig sollte auch die Suche nach potentiellen zellulären Interaktionspartnern auf Proteinebene intensiviert werden.
Publications
- (2007) The transmembrane segment S6 determines cation vesus anion selectivity of TRPM2 and TRPM8. J Biol Chem. 282:27598-27609
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- (2009) Inhibition of TRPM8 by icilin distinct from desensitization induced by menthol and menthol derivatives. J Biol Chem. 284:4102-4111
Kühn, F.J.P., Kühn, C., and Lückhoff, A.
- (2009) Role of an N-terminal splice segment in the activation of the cation channel TRPM2 by ADP-ribose and hydrogen peroxide. Neurochem. Res. 34:227-233
Kühn, F.J.P., Kühn, C., Naziroglu, M., and Lückhoff, A.
- (2010) Contribution of the S5-pore-S6 domain to the gating characteristics of the cation channel TRPM2 and TRPM8. J Biol Chem. 285:26806-26814
Kühn, F.J.P., Witschas, K., Kühn, C., and Lückhoff, A.
