Hochdruckgefriereinheit mit Kryosubstitution und Mikrotom
Final Report Abstract
Die Ca2+-abhängige Freisetzung von Hormonen aus neuroendokrinen Zellen und die Ca2+- abhängige Sekretion lytischer Granula aus zytotoxischen T-Lymphozyten werden durch eine Vielzahl von Proteinen ermöglicht bzw. reguliert. Im Rahmen der für die Beantragung des Gerätes angegebenen Projekte untersuchten wir die Funktion des „Ca2+-dependent activator protein for secretion“ (CAPS) in CAPS1/2 Doppelknockout (DKO)-Mäusen. Durch den Vergleich der Ultrastruktur von Chromaffinzellen von CAPS1/2 DKO Mäusen und Wildtyp-Kontrollen haben wir die Dichteverteilung und Lokalisation der LDCVs untersucht. Die Anzahl der „morphologisch gedockten“ Vesikel (Vesikel, die innerhalb eines Vesikelradius von <80 nm an der Plasmamembran liegen) unterscheidet sich nicht in den beiden Populationen. Wildtyp-Zellen und DKO-Zellen zeigen eine ähnliche Vesikelverteilung. Daraus konnten wir schließen, dass die verminderte Sekretion in den DKO-Zellen eher durch einen Defekt im Priming als im Docking der LDCVs hervorgerufen wird. Die elektronenmikroskopischen Analysen bestätigen die von uns publizierten Befunde und somit die elektrophysiologischen Messungen, die eine Funktion von CAPS bei der Befüllung des RRP nahelegen. Ferner konnten wir die Dichteverteilung und Lokalisation der LDCVs zur Plasmamembran an CAPS1/2 DKO-Mäusen und Wildtyp-Kontrollen untersuchen, die mittels viraler Transfektion das open-Syntaxin-eGFP Konstrukt überexprimierten. Durch die Überexpression dieses Proteins war es möglich einen Rescue des Primingdefekts in CAPS DKO Chromaffinzellen zu erzielen. Die Lokalisation der LDCVs zur Plasmamembran war deutlich verändert. In den open-Syntaxin überexprimierenden DKO und WT Chromaffinzellen waren deutlich weniger gedockte LDCVs als in den Kontrollzellen vorhanden. Durch die Überexpression von open-Syntaxin erfolgte somit ein unmittelbares Entleeren der an der Plasmamembran liegenden Vesikelpopulation. Ein weiterer wichtiger Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe sind zytotoxische T-Lymphozyten des Menschen und der Maus. Zytotoxische T-Lymphozyten sind ein wesentlicher Teil der zellulären Immunabwehr. Sie sind spezialisiert, mit Hilfe ihres T-Zell Rezeptorkomplexes (TZR) virusbefallene körpereigene Zellen zu erkennen und im Rahmen der dadurch eingeleiteten Immunreaktion abzutöten. Die Erkennung der virusbefallenen Zellen erfolgt über eine spezifische molekulare Interaktion zwischen dem sogenannten Haupt-Histokompatibilitätskomplex der Zielzelle (virusbefallene Zelle) und dem T-Zell Rezeptorkomplex (TZR) der ZTL. Das Erkennen führt zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, die zur Aktivierung der T-Zellen führt. Anschließend erfolgt eine Polarisation der Zelle und die Ausbildung einer immunologischen Synapse (IS). Lytische Granula, die Perforin und verschiedene Typen von Granzymen enthalten, werden ausgeschüttet und wirken zytotoxisch auf die Zielzelle und leiten deren Apoptose ein. Die Sekretion lytischer Granula ist ein hochkomplexer Prozess, der den schnellen Transport der zytotoxischen Granula zur Kontaktstelle zwischen T-Zelle und Zielzelle sowie den anschließenden Docking- und Fusionsschritt der Granula beinhaltet. SNARE-Proteine (v-SNARE und t-SNARE Proteine) sind essentielle Bestandteile der Fusionsmaschinerie bei der Ca2+-abhängigen Neurotransmitterfreisetzung. Welche Rolle SNARE-Proteine bei der Ca2+-abhängigen Exozytose von lytischen Granula spielen ist bisher noch nicht vollständig verstanden. Mittels Kombination lichtmikroskopischer und elektronenmikroskopischer Techniken (CLEM) konnten wir die Lokalisation des v-SNARE Proteins Synaptobrevin2 in GranzymB exprimierenden, lytischen Granula nachweisen und im elektronenmikroskopischen Bild Granula zuordnen, die einen dunklen, elektronendichten Kern aufweisen. Wir konnten somit zeigen, dass Synaptobrevin2 hochspezifisch auf lytischen Granula der ZTLs lokalisiert ist und an der Fusion der lytischen Granula mit der Plasmamembran während der zytotoxischen Interaktion mit der Zielzelle beteiligt ist.
Publications
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Niels de Jonge
- „Synaptobrevin2 is the v-SNARE required for cytotoxic T-lymphocyte lytic granule fusion.“ Nat. Commun. 2013, 4:1439
Matti U, Pattu V, Halimani M, Schirra C, Krause E, Liu Y, Weins L, Chang HF, Guzman R, Olausson J, Freichel M, Schmitz F, Pasche M, Becherer U, Bruns D, Rettig J
