Laserscanning-Mikroskop (LSM mit FLIM-Modul)
Final Report Abstract
Biophysikalische Untersuchungen an Festkörper-unterstützten Membranen: Ziel dieses Projekts ist die Rekonstitution von Protein in und auf Festkörper-unterstützten Membranen. Dazu werden Oberflächenarchitekturen entwickelt, welche eine Fusion von Proteoliposomen in Poylmerunterstützte Membranen ermöglichen. Diese Membranen sollen zur Untersuchung von Diffusion, Wechselwirkungen und Konformationen von Membranrezeptoren eingesetzt werden. Dafür wurden mikrostrukturierte Membranen entwickelt, um einzelne Proteine Proteinkomplexe für längere Zeit zu beobachten. Für diese Projekt wurde das Laserscanningmikroskop eingesetzt, um mikrostrukturierte Membranen zu abzubilden sowie um die Fluidität dieser Membranen und die Diffusion rekonstituierter Membranproteine mittels fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) zu charakterisieren. Mikrostrukturierung von Oberflächen zur spatiotemporalen Organisation von Proteinen: Zur funktionalen Organisation von Proteinen an Oberflächen wurden mikrostrukturierte Funktionalisierungsstrategien zur Immobilisierung von Proteinen entwickelt. Neben kovalenten und nichtkovalenten Kupplungsmethoden wurden neue Ansätze für eine in situ mikrostrukturierte Immobilisierung von Proteinen aus komplexen Probenmatrizes im Laserscanningmikroskop entwickelt. Dafür wurde ein nichtkovalentes caging von multivalenten Chelatoren auf der Oberfläche eingesetzt, die eine laserlithographische, lokale Freisetzung von Bindungsstellen ermöglicht. Mit dieser Strategie konnten verschiedene Proteine nacheinander funktional in komplexe Mikrostrukturen nichtkovalent und kovalent immobilisiert werden. Biofunktionalisierung von Nanopartikeln: Für die quantitative Untersuchung von Wechselwirkungen einzelner Proteine in lebenden Zellen sollen fluoreszente Nanopartikel funktionalisiert werden, um eine effiziente, stöchiometrisch definierte Markierung von Proteinen zu ermöglichen. Dazu wurden zum einen Strategien für eine gezielte Monofuktionalisierung von Nanopartikeln entwickelt, sowie Kupplungsstrategien, die eine effiziente, bioorthogonale Anbindung im Zytosol lebender Zellen ermöglichen. Mittels Laserscanningmikroskopie wurde die spezifische Markierung von Zielproteinen in Zellen bestätigt. Assemblierung und Dynamik von Protein-Komplexen: Zur Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen in lebenden Zellen wurde die Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) eingesetzt. Zudem wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Proteinkomplexe so zu Assemblieren, dass eine Untersuchung auf Einzelmolekülniveau im konfokalen Volumen möglich ist. Die Assemblierung von stabilen Komplexen wurde mittels FCCS und FLIM-FRET bestätigt. Spatiotemporale Organisation von Atmungskettenkomplexen in der inneren Mitochondrienmembran Zum Nachweis des TOM-Komplexes sowie Atmungskettensuperkomplexen (Respirasomen) wurde die FLIM/FRET Methode eingesetzt. Dabei wurden Änderungen der Donor-Lebenszeit aufgenommen. Auch echte Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation (GFP) wurde mittels FLIM überpüft. Zur pH Messung in Mitochondrien wurde ein ratio-metrisches superekliptisches pH-Luerin eingesetzt und die Emission bei zwei Wellenlängen parallel gemessen. Proteinausstausch zwischen Mitochondrien wurde mittels Ausbreitung von paGFP markierten Innenmembranproteinen bestimmt, nachdem ein kleiner Anteil von FP-markiertem Protein photoaktiviert worden war. Desweiteren wurden in 3D-Zeitreihen mitochondriale Bewegung, Morphologie und der Einfluss von Inhibitoren getestet.
Publications
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Functional immobilization and patterning of proteins by an enzymatic transfer reaction. Anal Chem 82 (2010), 1478-1485
Waichman, S., Bhagawati, M., Podoplelova, Y., Reichel, A., Brunk, A., Paterok, D., and Piehler, J.
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Native laser lithography of His-tagged proteins by uncaging of multivalent chelators. J Am Chem Soc 132 (2010), 5932-5933
Bhagawati, M., Lata, S., Tampe, R., and Piehler, J.
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Maleimide photolithography for single-molecule protein-protein interaction analysis in micropatterns. Anal Chem 83 (2011), 501-508
Waichman, S., You, C., Beutel, O., Bhagawati, M., and Piehler, J.
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Reconstitution of membrane proteins into polymer-supported membranes for probing diffusion and interactions by single molecule techniques. Anal Chem 83 (2011), 6792- 6799
Roder, F., Waichman, S., Paterok, D., Schubert, R., Richter, C., Liedberg, B., and Piehler, J.
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Selective targeting of fluorescent nanoparticles to proteins inside live cells. Angew Chem Int Ed Engl 50 (2011), 9352-9355
Lisse, D., Wilkens, V., You, C., Busch, K., and Piehler, J.
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Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angew Chem Int Ed Engl 51 (2012), 4868-4871
Wilmes, S., Staufenbiel, M., Lisse, D., Richter, C. P., Beutel, O., Busch, K. B., Hess, S. T., and Piehler, J.
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A versatile toolbox for multiplexed protein micropatterning by laser lithography. Small 9 (2013), 838-845
Gropeanu, M., Bhagawati, M., Gropeanu, R. A., Rodriguez Muniz, G. M., Sundaram, S., Piehler, J., and Del Campo, A.
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Diffusion and Interaction Dynamics of Individual Membrane Protein Complexes Confined in Micropatterned Polymer-Supported Membranes. Small 9 (2013), 570-7
Waichman, S., Roder, F., Richter, C. P., Birkholz, O., and Piehler, J.
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Restricted diffusion of OXPHOS complexes in dynamic mitochondria delays their exchange between cristae and engenders a transitory mosaic distribution. Journal of Cell Science 126 (2013): 103-116
Wilkens, V.; Kohl, W.; Busch, K.
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Spatial organization of lipid phases in micropatterned polymersupported membranes. J. Am. Chem. Soc. 135 (2013), 1189−1192
Roder, F., Birkholz, O., Beutel, O., Paterok, D., and Piehler, J.
