Die funktionelle Charakterisierung des Scavengerrezeptors CD163
Final Report Abstract
Das abgelaufene Projekt hat sich mit der Charakterisierung des Scavengerrezeptors CD163 in Monozyten befasst. Bei diesem Rezeptor handelt es sich um ein Membranmolekül, was hoch spezifisch auf Monozyten und Makrophagen exprimiert wird. Die Funktion dieses Rezeptors war weitgehend unklar. In dem abgelaufenen Projekt wurde diese Fragestellung zellbiologisch, biochemisch und an genetisch modifizierten Mausmodellen untersucht. Ein Schwerpunkt der Arbeiten befasste sich mit einer neu entdeckten Rolle dieses Rezeptors im Rahmen von bakteriellen Infektionen, insbesondere bei der Erkennung von Staphylococcus aureus. Wir konnten erstmalig zeigen, dass dieser Scavengerrezeptor eine direkte antimikrobielle Funktion aufweist. Diese führt er durch, indem er bestimmte Subfragmente des extrazellulären Matrixproteins Fibronektin erkennt. Fibronektin wird von Staphylokokken als Adhärenzsubstrat benutzt und findet sich deshalb gebunden auf der Oberfläche dieses Erregers. Der Scavengerrezeptor CD163 kann proteolytisch von der Oberfläche abgespalten werden und liegt dann als lösliche Form vor. Wir konnten zeigen, dass diese lösliche Form dies Scavengerrezeptors an das an Bakterien gebundene Fibronektin bindet. Die Freisetzung des Rezeptors ist von den Proteasen Adam 10 und 17 abhängig. Der gebundene Rezeptor fördert die Phagozytose von auf diese Weise opsonierten Bakterien und optimiert das Abtöten der Bakterien durch Monozyten. Zusätzlich kommt es zu weiteren parakrinen Effekten, da Staphylokokken opsoniert durch löslichen CD163 eine deutlich verbesserte Aktivierung und auch eine erhöhte Tötungseffizienz in nicht professionellen Phagozyten, wie z. B. Endothelien Zellen, induziert. Hierbei handelt es sich um eine sehr ausgeklügelte antimikrobielle Strategie, da Mutationen in Staphylokokken, die diesen Mechanismus umgehen würden, gleichzeitig einen wesentlichen Pathogenitätsfaktor, nämlich die Adhärenz an Fibronektin, verlieren würden. Neben diesem verstärkenden antimikrobiellen Effekt konnten wir darüber hinaus auch eine immunmodulatorische Funktion des löslichen CD163 nachweisen. Die entzündliche Aktivierung von Monozyten wurde signifikant durch die Bindung von löslichem CD163 an Staphylococcus aureus inhibiert. Auf diese Weise verhindert CD163 offensichtlich eine überschießende Reaktion von Monozyten auf eine Staphylokokken Infektion. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass CD163 die Expression des proapoptotischen Transkriptionsfaktors NR4A1 im Rahmen der Staphylococcus aureus Infektion inhibiert. Die Effekte, die durch lösliches CD163 hervorgerufen werden, stellen keine generelle Immunsupression dar, da z. B. die Aktivierung von MAP-Kinasen sowie die ROS-Produktion nicht betroffen waren. Demnach konnten wir zeigen, dass die Opsonierung von Staphylokokken durch lösliches CD163 eine spezifische Immunmodulation von Monozyten auf eine Staphylokokken Infektion bewirkt, die zu einer effizienteren Aufnahme und Abtötung der Bakterien führt, jedoch eine überschießende Entzündungsreaktion dämpft. Ein weiterer Schwerpunkt des abgelaufenen Projektes bestand in der Etablierung einer CD163-Knockout Maus. Wir konstruierten eine gefloxte Sequenz, die es in Kombination mit Cre erlaubt, das Exon 1 des CD163-Gens zu eliminieren. Es gelang uns, im Zeitplan positive ES-Zell-Klone zu selektionieren und eine Maus-Chimäre erfolgreich zu etablieren. Allerdings führte die Kreuzung unserer Founder- Linie mit einem generellen Cre-Deleter nicht zur Zerstörung des CD163-Gens. Detaillierte Analysen ergaben erstaunlicher Weise, dass die zweite Flox-Schnittstelle in den transgenen Tieren nicht mehr nachweisbar war. Diese war jedoch in den ES-Zelllinien regulär vorhanden. Es muss somit zu einer äußerst ungünstigen Rekombination im Laufe der Herstellung oder Züchtung dieser Mauslinie gekommen sein. Wir starteten deshalb mit den vorhandenen ES-Zelllinien erneut und konnten inzwischen erfolgreich eine CD163-Knock-out-Maus etablieren, die wir in der 6. Generation sowohl auf den C57black/6- wie auch auf den Balb/C Hintergrund in der 6. Generation rückgekreuzt haben. Diese Mauslinien wurden in ersten experimentellen Ansätzen bereits verwendet. Des Weiteren konnten wir erfolgreich das komplette CD163-Molekül der Maus rekombinant in einem eukaryotischen System exprimieren und Western Blott gängige Antikörper gegen dieses Molekül herstellen. Uns gelang die molekulare Charakterisierung dieses Moleküls. Abschließend konnten wir nachweisen, dass die Expression von CD163 in der Maus eine sehr spezifische Makrophagenpopulation charakterisiert. Diese Population geht bei vielen gängigen Reinigungsmethoden verloren, da diese Zellen aufgrund ihrer ferromagnetischen Eigenschaften auf einer Magnetreinigungssäule hängen bleiben. Die Population ist streng IRF8 abhängig und zeigt deutliche immunmodulatorische Funktionen im Sinne einer erhöhten Phagozytoserate und ROS-Produktion, einer starken IL10, aber schwachen IL1- Expression auf. In verschiedenen Tiermodellen konnten wir bereits die Relevanz dieser Makrophagenpopulation nachweisen. Zusammenfassend konnte unser Projekt belegen, dass CD163 eine sehr spezifische Makrophagenpopulation charakterisiert, die sowohl infektionsbiologisch wie auch immunmodulatorisch von hoher Relevanz ist. Die Fortsetzung des Projektes wird in erster Linie die funktionelle Charakterisierung der CD163-/- und IRF8-/- Mäuse umfassen sowie Analysen zur Herkunft dieser Makrophagenpopulation. Die Rolle von CD163 in Staphylokokkeninfektionen wird in der CD163-/- Maus in einem SFB-Projekt behandelt, dass in der zweiten Jahreshälfte 2014 starten wird (Transregio 34).
Publications
- ”sCD163 is a novel receptor for fibronectin involved in recognition, phagocytosis and killing of Staphylococcus aureus.” Cell. Microbiol. 14, 914-936 (2012)
Kneidl, J., B. Löffler, M. C. Erat, J. Kalinka, G. Peters, J. Roth, and K. Barczyk
- ”Soluble CD163 masks fibronectin-binding protein A-mediated inflammatory activation of Staphylococcus aureus infected monocytes.” Cell. Microbiol. 16; 364-377 (2014)
Kneidl , J., B. Löffler , D. Holzinger, J. Roth, and K. Barczyk
(See online at https://doi.org/10.1111/cmi.12225)
