The mechanism of molybdenum cofactor-insertion into apo-enzymes of the sulfite oxidase-class
Final Report Abstract
In den vergangenen Jahren hat unsere Gruppe die Grundlagen des Molybdän-Metabolismus in Pflanzen und im Menschen mit über 20 teilnehmenden Proteinen aufgeklärt. Während die grundlegenden Funktionen der einzelnen Proteine mittlerweile klar sind, wollten wir nun die Details zugrundeliegender Prozesse des letzten Moco-Biosynthese Schrittes aufklären. In diesem durch die Mo-Insertase Cnx1E katalysierten Teilschritt wird Molybdat in Molybdopterin inseriert. Durch die Kombination von strukturbiologischen und biochemischen Daten war es möglich, die postulierte MPT-AMP Bindungstasche zu verifizieren, wobei eine bisher nicht beschriebene MPT-AMP Konformation identifziert wurde. Durch die Analyse von funktionsinaktiven Cnx1E Varianten gelang die Identifizierung eines bisher unbekannten Moco-Biosynthese Intermediates: ´Mocox-AMP´. Die Identifizierung von Cnx1E gebundenem Mocox-AMP ermöglichte es, die zugrundeliegenden Prinzipien der Moco Molybdän-Zentrum Bildung nachzuvollziehen. In einer zweiten Projektlinie charakterisierten wir die Moco-freie Form der tierischen Sulfitoxidase des filamentösen Pilzes Neurospora crassa. Diese liegt – anders als weithin für diese Enzymklasse angenommen – wahrscheinlich assoziiert an der inneren Mitochondrienmembran vor und eben nicht löslich im mitochondrialen Intermembranraum. Für das Schwesterenzym der Neurospora crassa Sulfitoxidase, die Nitratreduktase, wurde bereits gezeigt, dass der Häm-Gehalt des Moco-freien Enzyms Wildtyp-ähnlich ist. Dieses trifft auch für die rekombinante, Moco-freie tierische Sulfitoxidase aus Neurospora zu, was auch hier die funktionelle Rekonstitution des rekombinanten, Mocofreien Enzyms erlaubte. Letztere ist abhängig von zwei Cystein-Paaren, die im C-terminalen Bereich des Enzyms vorliegen und bei der Neurospora crassa Nitratreduktase fehlen. Hingegen weisen Nitratreduktase und Sulfitoxidase eine kleine helikale Domäne auf, die wahrscheinlich an der molekularen Erkennung von enzymgebundenem Moco beteiligt ist, was einhergeht mit Dimerbildung. Demzufolge sind die benachbarten Cysteinpaare der Neurospora crassa Sulfitoxidase eine Besonderheit, die ihrer subzellulären, d.h. membranassoziierten Lokalisierung geschuldet ist.
Publications
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