Deciphering the role of adenosine nucleosidases (ADNs) - closing a gap in purine and cytokinin metabolism
Final Report Abstract
Nukleotide sind Bestandteile und Vorstufen zahlreicher wichtiger Substanzen, wie z.B. Nukleinsäuren, ATP, NAD+ sowie Alkaloide und Cytokinine, so dass der Metabolismus von Purinen und Pyrimidinen eine zentrale Bedeutung besitzt. In diesem Kontext nimmt das Enzym Ribohydrolase (RH), das die hydrolytische Spaltung von Ribosiden in Basen und Ribose katalysiert, eine wichtige Position ein. Während mikrobielle RHs im Detail charakterisiert sind, liegen zu RHs aus Pflanzen kaum Informationen vor. Innerhalb des Projektes erfolgte eine umfassende Charakterisierung und Funktionsanalyse von RHs aus Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G., einem Modellsystem für basale Landpflanzen. Aus in vivo und in vitro Messungen sowie Markierungsexperimenten mit 3H-Purin-Ribosiden ging eindeutig hervor, dass Physcomitrella RH-Aktivität besitzt. Phylogenetische Analysen zur Erstellung eines Stammbaumes für pflanzliche RHs ergaben zwei Hauptgruppen, wobei die meisten Spezies je einen Vertreter in beiden Gruppen aufweisen. Auf Ebene der genomischen Organisation wurde gezeigt, dass PpRH1 , -2 und -3 eine hoch konservierte Intron/Exon-Struktur mit den meisten pflanzlichen RHs teilen. Für einen funktionellen Nachweis und die Untersuchung der enzymkinetischen Parameter erfolgte die heterologe Expression in E. coli. Enzymassays identifizierten PpRH1 als eine Purin-bevorzugende RH, die neben Inosin als Hauptsubstrat auch Aktivität an Adenosin, Guanosin, Xanthosin, dem Pyrimidin Uridin und dem Cytokinin Isopentenyladenosin (iPR) zeigt. Rekombinantes PpRH2-Protein weist eine insgesamt niedrigere katalytische Aktivität als PpRH1 auf und setzt vorrangig das Pyrimidin Uridin um. Erste Kristallisierungsansätze zur Entschlüsselung der 3D-Struktur von PpRH1 wurden realisiert. Anhand von site directed mutagenesis Experimenten wurde die Bedeutung katalytisch wichtiger Aminosäuren untersucht. Die Expression von PpRH-GFP-Fusionsproteinen in Physcomitrella Protoplasten zeigten übereinstimmend eine cytoplasmatische Lokalisierung für PpRH1, -2 und -3 auf. LC-MS/MS-basierte Messungen wurden vorgenommen, um Gehalte von Purinen und Pyrimidinen im Gewebe von Physcomitrella zu erfassen. Das erstellte Purin/Pyrimidin-Profil umfasste 15 verschiedene Purin- und Pyrimidin-Metabolite. Single-knockout Linien von PpRH1, -2 und -3 wurden hergestellt, um Daten zur physiologischen Relevanz von RHs zu gewinnen. Mittels HPLC-basierter in vivo Metabolismusstudien mit radioaktivmarkierten Purinen und Cytokininen, sowie LC-MS/MS-basierter Messung von steady state Gehalten von Purinen,Pyrimidinen und Cytokininen, wurden die Folgen der unterschiedlichen RH- knockouts analysiert: Kaum Auswirkungen zeigte der knockout von PpRH3, hingegen wurde nach dem knockout von PpRH2 intrazellulär eine Akkumulation des Ribosids Uridin gemessen. Am stärksten ausgeprägt waren die KO-bedingten Effekte für PpRH1: LC-MS/MS Messungen wiesen eine generelle Akkumulation von Ribosiden im Gewebe nach. Aus den zu PpRH1 und PpRH2 erhobenen Ergebnissen werden folgende Schlussfolgerungen gezogen: PpRH2 repräsentiert eine RH-Nebenaktivität, die vorrangig auf die Hydrolyse von Pyrimidin-Ribosiden zielt und vermutlich hauptsächlich im Entwicklungsstadium des Gametophors von Bedeutung ist. PpRH1 übernimmt hingegen essentielle Funktionen im Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel, und stellt die RH-Hauptaktivität zum Abbau von Purin- und Pyrimidin-Ribosiden dar. Es wurde eindeutig gezeigt, dass PpRH1-Aktivität für die Rückführung von Adenosin gebundenem Stickstoff essentiell ist. Neben dem Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel wird eine Rolle von PpRHs beim Cytokinin-Stoffwechsel aufgezeigt. Die Projektergebnisse liefern einen Beitrag zur Aufklärung der multiplen physiologischen Funktionen von RHs im pflanzlichen Stoffwechsel von Purinen, Pyrimidinen und Cytokininen.
Publications
- (2009): Cytokinin profile, metabolism and biosynthesis in the moss Physcomitrella patens, beim ACPD 2009 Meeting in Prag, Tschechien
Hanna Turcinov, Ann-Cathrin Lindner, Marta Fernández Núñez, Natalya Yevdakova, Niels Wegner, Václav Motyka, Miroslav Strnad, Ondřej Novák and Klaus von Schwartzenberg
- (2011): Identifizierung und Charakterisierung der Ribohydrolase-(RH)-Familie aus dem Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. und ihr funktioneller knockout; Doktorarbeit an der Universität Hamburg
Hanna Turcinov
- (2011): Nucleoside hydrolases from Physcomitrella, beim Moss2011 Meeting in Herzogenhorn/ Schwarzwald, Deutschland
Hanna Turcinov, Katja Engel, Jeanette Klein, David Kopečný, Martina Tylichová, Barbara Moffatt, Klaus von Schwartzenberg
